作者：刘蓉， 鞠艳芳， 杨金菊， 杜雪梅， 陈勇， 刘莹， 高建恩， 孙启鸿
【摘要】 目的: 制备小鼠抗人烯脂酰辅酶A水解酶（enoyl CoA hydratase， ECHS1）的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体， 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠， 采用杂交瘤技术制备mAb， 并通过间接ELISA、 Western blot、 免疫沉淀、 免疫组化和间接免疫荧光等方法对mAb进行特异性鉴定， 通过Uni-ZAP XR正常成人肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原。结果: 获得1株可稳定分泌抗人ECHS1 mAb 的杂交瘤细胞株BGB095。该mAb的Ig亚类(型)为IgG1（κ）， 可用于ELISA检测、 Western blot、 免疫沉淀、 免疫组化等实验。结论: 成功制备了抗人ECHS1的mAb， 为代谢疾病和肿瘤的研究提供了有力的工具。
【关键词】 ECHS1 单克隆抗体 线粒体
烯脂酰辅酶A水解酶（enoyl CoA hydratase， ECHS1）是线粒体脂肪酸β-氧化中的关键酶， 在第2步水化反应中催化烯脂酰辅酶A水化生成L-3-羟脂酰辅酶A［1］。线粒体脂肪酸β-氧化是体内脂肪酸分解供能的主要途径， 尤其是在主要能量来源葡萄糖缺少的情况下。遗传性线粒体脂肪酸β-氧化功能障碍导致一类相对较新的代谢疾病出现， 可以导致婴儿猝死综合征和瑞氏综合征等病症［2］。此外， 烯脂酰辅酶A水解酶作为线粒体脂肪酸β-氧化中的关键酶， 还在多种肿瘤如肝细胞癌、 肾细胞癌、 前列腺癌和结肠直肠癌等的发生发展中发挥着重要的作用［3， 4］。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体（mAb）库的建立中， 应用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb， 获得1株可稳定分泌抗人ECHS1 mAb的杂交瘤细胞株， 并对其特异性进行了鉴定， 这为进一步研究ECHS1在代谢疾病和肿瘤发生中的作用奠定了实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料 免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白和小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0由军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室制备。BALB/c小鼠购自军事医学科学院动物中心; 福氏佐剂购自Sigma公司; HRP-羊抗小鼠IgG和TRITC-羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 蛋白酶抑制剂购自Roche公司; BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司; PVDF膜和ECL反应试剂盒购自Amersham公司; DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 成人肝组织匀浆700～750 r/min， 上下5次， 10 g组织加40 mL匀浆缓冲液， 匀浆液用800 g离心10 min， 取上清， 10000 g离心10 min， 沉淀即为线粒体， 用匀浆缓冲液洗2次。用RIPA裂解液裂解线粒体样品， 离心后取上清， 获得线粒体总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度， 计算线粒体得率， 通过测定匀浆液和分离的线粒体中琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度， SDS-PAGE鉴定抗原的相对分子质量（Mr）［5］。
1.2.2 鼠抗人ECHS1 mAb的制备 将线粒体总蛋白1 mg与等体积福氏完全佐剂进行充分乳化， BALB/c小鼠背部多点皮下注射。首次免疫后4周进行2次免疫， 1周后经尾静脉取血， 分离血清， ELISA法测定效价。融合前3 d进行加强免疫， 取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0细胞进行细胞融合， 采用杂交瘤技术制备mAb。
1.2.3 抗原的鉴定 （1）免疫沉淀鉴定: 应用BGB095 mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀得到相应的抗原， 加入5×还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备蛋白样品并进行SDS-PAGE电泳， 电转蛋白至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h， 然后加入BGB095杂交瘤细胞培养上清， 4℃孵育过夜， TBST缓冲液洗膜后， 加入HRP-羊抗小鼠IgG抗体（1∶5000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。（2）筛选Uni-ZAP XR正常成人肝脏cDNA表达文库鉴定抗原: 取大肠杆菌XL1-BLUE MRF’过夜培养菌接种于LB培养液中， 37℃震荡培养至A600为0.8左右， 3000 r/min下离心10 min， 用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至A600为0.5， 取适当稀释的文库60 μL（含约50000个噬菌体）与600 μL重悬的XL1-BLUE MRF’混匀后37℃温育20 min， 铺至150 mm的NZY-LB平板上， 42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见， 将浸泡过IPTG的NC膜覆盖于其表面， 37℃继续培养3.5 h， 用防水墨水定位后， 剥离滤膜， 进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆， 用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及Western blot分析。
1.2.4 BGB095 mAb的鉴定 （1）Western blot分析: 在线粒体总蛋白分别加入5×还原型或非还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备蛋白样品并进行SDS-PAGE电泳， 电转蛋白至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h， 然后加入BGB095杂交瘤细胞培养上清， 4℃孵育过夜， TBST缓冲液洗膜后， 加入HRP-羊抗小鼠IgG抗体（1∶5000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。（2）免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片， PBST浸洗5 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin50 mL（屏蔽体内生物素的作用）， 室温孵育15 min， 滴加30 mL/L h3O2-甲醇， 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭30 min， 加入杂交瘤细胞株BGB095的培养上清， 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入HRP-羊抗小鼠IgG， 37℃孵育30 min， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 返蓝后封片。（3）间接免疫荧光检测: 取达到对数生长期的单层Huh7细胞， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液， 接种至预先放置7 mm×22 mm盖玻片的6孔板内， 于37℃、 50 mL/L CO2细胞培养箱内培养30～35 h后， 罗丹明染色30 min， PBS清洗2次， 用40 g/L多聚甲醛固定10 min; PBS清洗3次后滴加羊血清工作液37℃封闭30 min; 滴加BGB095细胞培养上清， 4℃过夜; PBS清洗标本3次， 吹干; 滴加TRITC-羊抗小鼠IgG， 37℃孵育30 min; PBS洗3次; 500 mL/L甘油封片， 荧光显微镜下观察拍照。
2 结果
2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 通过差速离心方法分离线粒体， 每克肝组织可得到8～10 mg线粒体蛋白。通过测定琥珀酸脱氢酶活性并计算线粒体富集度， 多次结果显示为线粒体富集度为4～7倍， 可作为免疫动物的抗原。
2.2 鼠抗人mAb的制备及初步鉴定 应用细胞融合、 筛选和克隆化， 获得1株抗人肝脏线粒体阳性的细胞株BGB095， 经ELISA检测效价约为1∶512000， 其亚类（型）为IgG1（κ）。
2.3 抗原特异性鉴定 （1）抗原的Western blot和免疫沉淀鉴定: 应用成人肝线粒体总蛋白和BGB095从线粒体总蛋白中免疫沉淀得到的相应抗原进行Western blot分析， 结果显示， BGB095特异识别成人肝线粒体组织中Mr约为31000的蛋白（图1）。（2）筛选Uni-ZAP XR人肝脏cDNA表达文库鉴定抗原: 用获得的BGB095细胞培养上清对正常成人肝脏cDNA表达文库进行初次筛选， 挑取阳性噬菌斑进行复检， 得到单克隆的阳性噬菌斑约15个， 分离2个独立的阳性克隆进行体内剪切和测序。将测序结果进行Blast比对， 结果表明BGB095识别的抗原为烯脂酰辅酶A水解酶。为了对测序的阳性克隆进行进一步验证， 又对分离得到的阳性克隆进行了Western blot鉴定。结果显示， BGB095 mAb识别Mr为42000的重组表达蛋白， Mr较小的条带可能为降解产物（图2）。
图1 BGB095 mAb的Western blot和免疫沉淀分析（略）
1: 线粒体总蛋白加非还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备的蛋白样品; 2: 使用正常小鼠血清从线粒体总蛋白中免疫沉淀得到的蛋白加还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备的蛋白样品; 3: 使用BGB095 mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀得到的蛋白加还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备的蛋白样品; 4: 线粒体总蛋白加还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备的蛋白样品.
图2 BGB095 mAb的Uni-ZAP XR表达文库筛选阳性克隆重组表达蛋白的Western blot鉴定（略）
1: 阳性克隆1; 2: 阳性克隆2.
2.4 BGB095 mAb的免疫组化和间接免疫荧光鉴定 免疫组化实验结果显示， 鼠抗人ECHS1 mAb识别的抗原定位于成人肝细胞胞质中; 间接免疫荧光实验进一步明确ECHS1 mAb识别的蛋白位于线粒体（图3、 4）。
图3 ECHS1 mAb的免疫组化鉴定(×400)（略）
A: 阴性对照 (正常小鼠血清); B: ECHS1 mAb BGB095.
图4 BGB095识别抗原的亚细胞器定位(×400)（略）
A: 线粒体特异性标记物罗丹明123（绿色荧光）; B: TRITC-羊抗小鼠IgG（红色荧光）; C: A和B的重叠图形， 所形成的黄色荧光提示ECHS1 mAb 识别的蛋白位于线粒体.
3 讨论
ECHS1是体内脂肪酸代谢和改造的关键酶， 在线粒体β-氧化中发挥着重要的作用。目前越来越多的研究表明， ECHS1不仅可以引起一系列代谢性疾病， 还与多种肿瘤的发生发展密切相关。ECHS1在基因结构上具有高度的保守性， 并与其他多种水解酶和异构酶如Δ2， Δ3-烯酰辅酶A异构酶和4-氯苯甲酰辅酶A去卤酶等在基因序列上具有相当高的一致性， 因而将其归为水解酶/异构酶超家族［6］。ECHS1单体的相对Mr为31000， 在天然状态下ECHS1以六聚体的形式存在， 其单体可与乙酰乙酰基辅酶A、 辛酰辅酶A和4-（N，N-二甲氨基）苯乙烯醛基辅酶A等酶类形成复合物［7］。我们在文库筛选过程中利用大肠杆菌系统重组表达了ECHS1， 通过Western blot鉴定其Mr为42000， 基于ECHS1的结构特点， 我们考虑该结果很可能与ECHS1体内酶复合作用有关， 对于这一问题的研究目前仍在进行之中。
我们制备的ECHS1 mAb可以应用于ELISA、 Western blot、 免疫沉淀、 免疫组化和间接免疫荧光等实验， 为进一步研究ECHS1在代谢和肿瘤中的作用、 ECHS1的结构特点以及水解酶/异构酶超家族的功能提供了有力的工具。
参考文献
［1］ Uwe J， Elizabeth D， Michelle L， et al. Human mitochondrial Enoyl-CoA hydratase gene (ECHS1): structural organization and assignment to chromosome 10q26.2-q26.3［J］. Genomics， 1997， 40(3): 470-475.
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［3］ Lin JF， Xu J， Tian HY， et al. Identification of candidate prostate cancer biomarkers in prostate needle biopsy specimens using proteomic analysis［J］. Int J Cancer， 2007， 121(12): 2596-2605.
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［5］ Gao JE， Gao Y， Ju YF， et al. Proteomics-based generation and characterization of monoclonal antibodies against human liver mitochondrial proteins［J］. Proteomics， 2006， 6(2): 427-437.
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［7］ Gautam Agnihotriy， Liu HW. Enoyl-CoA hydratase: reaction， mechanism， and inhibition［J］. Bioorg Med Chem， 2003， 11(1): 9-20.