作者：陈章权*， 黄震， 梁晓东， 陆田田， 何天文
【摘要】 目的: 原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体。方法: 用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因， 将其克隆入原核表达载体pET28中， 转化大肠杆菌BL21（DE3）， 用IPTG诱导重组蛋白的表达， 用亲和层析法纯化重组蛋白， 以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体， 并以ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果: 在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白， 用其免疫小鼠， 获得了效价高、 特异性较好的多克隆抗体， 免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子。结论: 成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体， 为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础。
【关键词】 CD1d 基因 表达 抗体 制备
CD1分子是独立于MHC分子之外的第三类抗原提呈分子， 分为CD1-I和CD1-II两组， 前者包括CD1a、 CD1b、 CD1c和CD1e等4个分子， 后者只有CD1d分子［1］。CD1d分子由胞内区、 跨膜区和胞外区组成， 胞外区又由α1、 α2和α3等3个结构域组成， 它主要提呈糖脂抗原， 在免疫调节及与感染性疾病、 自身免疫性疾病、 肿瘤等疾病的发生发展过程中起重要作用［1， 2］。在CD1d基因克隆过程中， 我们发现在某些疾病患者体内存在α3结构域或跨膜区缺失的变异体， 跨膜区缺失的变异体的存在提示患者体内可能存在可溶性CD1d分子。为此， 我们拟建立双抗体夹心ELISA法进行可溶性CD1d分子的检测， 但目前尚未见有其商品化ELISA检测试剂盒。特异性抗体的获取是建立ELISA检测方法的关键所在， 在成功制备兔抗人CD1d分子 α3结构域抗体［3］的基础上， 我们又对人CD1d分子胞外区编码基因进行了重组表达， 并制备了其鼠源性抗体。
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5α、 大肠杆菌DL21-DE3为本室保存。克隆载体pGEM-T、 反转录试剂盒购自Promega公司; 表达载体pET28和Ni2+-NTA凝胶为Invitrogen公司产品。RNA提取试剂、 PCR产物回收、 质粒纯化试剂盒为QiaGen公司产品。Taq酶购自大连宝生物工程公司。IPTG及DAB购自上海生物工程有限公司。HRP标记的羊抗鼠IgG为Chemicon公司产品。PVDF膜为美国PALL公司产品， 常规试剂为国产分析纯。引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完成。BALB/c小鼠由广东医学院实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 CD1d分子胞外区编码基因的克隆 取手术切除的新鲜人小肠组织抽提RNA， 经鉴定RNA无降解后进行反转录， 操作按反转录试剂盒说明进行。以合成的cDNA为模板进行hCD1d 胞外区编码基因扩增， 引物如下: 1: 5′-CCATGGTCCCGCAAAGGCTTTTCCC-3′(划线部分为Nco I酶切位点)， 引物2: 5′-CTCGAGCCAGTAGAGGACGATGTCCTG-3′(划线部分为Xho I酶切位点)。PCR 条件为94℃变性30 s， 55℃退火50 s， 72℃延伸40 s， 32个循环后， 于72℃延伸7 min。PCR 产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。将纯化的PCR产物与pGEM-T载体连接后， 转化感受态大肠杆菌DH5α。转化菌液涂布于含氨苄青霉素、 X-gal和IPTG的LB平板， 于37℃培养过夜， 挑取白色菌落进行培养， 提取重组质粒， 以EcoR I进行酶切鉴定， 将质粒命名为pGEM-T/hCD1d。阳性克隆进行DNA 测序， 对所得序列用BLAST 软件进行序列同源性分析。
1.2.2 原核表达载体的构建 用Nco I和Xho I分别对pGEM-T/hCD1d质粒和原核表达载体pET28进行双酶切， 凝胶电泳后， 纯化回收切下的hCD1d基因片段和pET28片段， 并用连接酶将2个片段16℃连接过夜， 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞， 然后将菌液涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板， 筛选阳性表达克隆， 进一步用 PCR和测序进行鉴定， 命名为pET28/hCD1d。
1.2.3 目的蛋白的诱导表达 重组质粒pET28/hCD1d转化感受态菌大肠杆菌BL21(DE3)， 37℃培养过夜。挑取菌落经PCR筛选及测序鉴定正确后， 接种于 LB液体培养基（含50 mg/L卡那霉素）， 37℃培养过夜后， 按1∶100比例接种到LB液体培养基中， 待菌液的A600值达0.5 ~0.6时加入IPTG(终浓度为1 mmol/L)， 37℃诱导表达5 h， 离心收集菌体， 超声破碎后， 分别取细菌裂解上清、 沉淀部分及总菌蛋白行SDS-PAGE分析， 取未经诱导的重组菌为对照。
1.2.4 蛋白复性与纯化 离心收集500 mL经诱导表达的菌体， 冰浴条件下超声破菌， 15000 g离心15 min， 分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE确定目的蛋白主要存在于沉淀中后， 用洗涤液（50 mmol/L PBS， pH8.0， 1 mmol/L EDTA， 2 mol/L尿素）洗涤沉淀。离心后获取沉淀溶于8 mol/L的尿素中， 用稀释法对包涵体进行复性处理。将溶解的产物用复性缓冲液（20 mmol/L PBS， pH8.0， 1 mmol/L还原型谷胱甘肽， 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽）行稀释复性过夜。离心收集上清， 用Ni2+-NTA凝胶柱进行纯化， 200 mmol/L咪唑洗脱， 具体操作步骤按说明书进行。
1.2.5 抗体的制备、 纯化及鉴定 取6周龄小鼠，用纯化的重组蛋白加福氏完全佐剂， 皮下多点注射， 共免疫3次， 间隔时间为2周， 每次注射抗原50 μg。免疫完毕， 摘除小鼠眼球取血、 分离血清。用间接ELISA法检测抗体效价， 用Western blot进行抗体特异性鉴定， 方法参照文献［4］进行。应用所制备的抗人CD1d抗体检测人肠组织石蜡切片， 进行免疫组织化学检测， 对抗体的活性作进一步的分析， 多抗按1∶500稀释， 采用DAB显色。同时以正常小鼠血清作对照。
2 结果
2.1 CD1d分子胞外区编码基因的扩增与鉴定 PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析， 在约850 bp处见有一特异条带， 与预期的目的片段大小相符。提取质粒， 经PCR和Nco I与Xho I双酶切鉴定， 扩增产物和酶切下来的片段与预期的片段大小相符， 经进一步测序鉴定， 得到CD1d胞外区编码基因片段为825 bp， 用BLAST程序分析， 序列与GenBank登录的序列(登录号: NM 001766)一致， 阳性克隆命名为pGEM-T/hCD1d（图1）。
图1 hCD1d 胞外区编码基因扩增产物（略）
Fig 1 The PCR products of the gene coding for hCD1d extracellular region
M: DNA marker; 1， 2: PCR product of hCD1d extracellular region.
2.2 表达载体pET28/CD1d的构建与鉴定 构建的原核表达质粒pET28/hCD1d经PCR筛选和DNA序列测定， 结果显示目的片段大小为825 bp， 正确插入质粒pET28， 碱基序无突变， 阅读框正确， 可用于下一步的诱导表达。
2.3 重组蛋白的诱导表达、 纯化与鉴定 将表达质粒pET28/hCD1d转化大肠杆菌BL21（DE3）， 得到含重组质粒的基因工程菌。经IPTG诱导， SDS-PAGE分析， 结果显示在相对分子质量（Mr）约30000处有一条外源的高表达蛋白条带， 与预测的目的蛋白的Mr大小相吻合， 而未经IPTG诱导的工程菌未见有外源蛋白表达条带， 仅转入pET28空载体的菌株在IPTG诱导后也未见有外源蛋白表达条带， 表明hCD1d在大肠杆菌中得到了高效表达。超声破菌后， 离心取上清和沉淀行SDS-PAGE分析， 结果显示表达产物大多数在沉淀中， 说明重组蛋白主要以包涵体的形式存在（图2A）。包涵体用8 mol/L的尿素溶解后复性， 离心收集上清， 经Ni-NTA纯化， 得到约2 mg蛋白， 经凝胶扫描分析显示， 所得的蛋白纯度为92%， 纯度较高（图2A）。
2.4 抗血清的效价及特异性的鉴定 利用纯化的重组人CD1d为抗原免疫小鼠， 获得鼠抗hCD1d抗血清， ELISA检测效价为1∶12800。以制备的抗人CD1d抗血清作一抗， 进行Western blot检测， 结果显示， 在Mr约30 000处的诱导表达菌蛋白及纯化蛋白出现了一条特异反应条带， 而在未加诱导剂的工程菌体蛋白中未见有反应条带（图2B）， 表明所制备的抗体与人CD1d特异结合。对人肠组织免疫组织化学染色结果显示， 用所制备的抗体作为一抗有明显的阳性着色， 抗原分布主要呈浆膜型和胞质型， 而应用正常小鼠血清为一抗则无阳性着色（图3）， 说明抗体具有良好的活性和高特异性。
图2 重组hCD1d的SDS-PAGE和Western blot分析（略）
Fig 2 Analysis of the recombinant hCD1d by SDS-PAGE and western blot
A: 1: Purified recombinant hCD1d; 2: pET28/hCD1d transformed E.coli BL21(DE3) without IPTG induction; 3， 4: pET28/hCD1d transformed E.coli BL21(DE3) with IPTG induction; 5: pET28 transformed E.coli BL21(DE3) with IPTG induction; M: Protein marker. B: 1: pET28/hCD1d transformed E.coli BL21(DE3) without IPTG induction; 2: pET28/hCD1d transformed E.coli BL21(DE3) with IPTG induction; 3: Purified recombinant hCD1d.
图3 免疫组织化学检测抗hCD1d分子抗体特异性（略）
Fig 3 The analysis of specificity of the mouse anti-hCD1d antibody by immunohistochemistry on human small intestinal tissue （×100）
A: Anti-hCD1d as primary antibody; B: Negative control (normal mouse serum).
3 讨论
采用RT-PCR技术从人小肠组织中获取了人CD1d分子胞外区编码基因， 经DNA序列测定表明所得序列正确， 碱基无突变， 构建了其原核表达载体， 在大肠杆菌中高效诱导表达了其重组蛋白。在重组蛋白的制备过程中， 发现重组CD1d分子胞外区蛋白主要以包涵体的形式存在， 重组蛋白经稀释法复性后， 用咪唑洗脱， 效果良好。以纯化的重组蛋白为免疫原免疫小鼠， 制备了效价高、 特异性好的多克隆抗体， 免疫组织化学染色检测显示该抗体能识别天然的CD1d分子， 具有良好的活性。
NKT细胞主要识别CD1d分子提呈的糖脂抗原， 而各种病原生物表面富含脂类物质。目前研究表明柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3， CVB3)、 丙型肝炎病毒、 脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus， EMCV)等病毒感染后， 感染细胞CD1d迅速上调［5］， 而HIV感染患者体内CD1d(+)单核细胞表面表达的CDld分子则明显低于正常人［6］， 其表达水平的降低可能与HIV感染患者的免疫功能受到损害有关， 目前有关病毒感染后体内CD1d表达水平的检测仅见于上述几种病毒感染， 其他病毒感染细胞CD1d表达水平如何有待进一步研究。急性B淋巴细胞白血病患者中的前B细胞（B-cell precursor）的CD1d分子的表达呈现高表达， 其预后则较差［7］。Haraguchi等研究表明肿瘤表面高表达CD1d分子的小鼠存活期比低表达的小鼠长［2］， 提示肿瘤细胞表面CD1d分子的表达水平可能是进行免疫治疗的一个重要指标， 目前有关肿瘤患者CD1d分子表达水平的研究报道较少。另外， Kojo等［8］从基因水平研究表明类风湿性关节炎患者体内表达有低水平的可溶性CD1d分子， 我们在实验中也发现某些疾病患者体内存在跨膜区缺失的CD1d分子表达， 但迄今尚未见有患者血清中可溶性CD1d分子检测的研究报道， 其存在的生物学意义有待进一步揭示。在制备兔抗人CD1d α3结构域抗体的基础上， 我们又成功制备了鼠抗人CD1d分子胞外区抗体， 来源于2种不同种属动物、 且抗原表位有异的抗人CD1d分子抗体的成功制备， 为进一步建立人CD1d分子的ELISA检测方法和CD1d分子在相关疾病的作用研究奠定了良好基础。
参考文献
［1］ Zimmer MI， Colmone A， Felio K， et al. A cell-type specific CD1d expression program modulates invariant NKT cell development and function［J］. J Immunol， 2006， 176(3): 1421-1430.
［2］ Haraguchi K， Takahashi T， Nakahara F， et al. CD1d expression level in tumor cells is an important determinant for anti-tumor immunity by natural killer T cells［J］. Leuk Lymphoma， 2006， 47(10): 2218-2223.
［3］ 陈章权， 黄 震， 梁晓东， 等. 兔抗人CD1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2008， 24(3): 250-252.
［4］ 陈章权， 何素辉， 陆田田， 等. 兔抗人肥大细胞羧肽酶抗体的制备与鉴定［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(9): 859-861.
［5］ Ilyinskii PO， Wang R， Balk SP， et al. CD1d mediates T-cell-dependent resistance to secondary infection with encephalomyocarditis virus (EMCV) in vitro and immune response to EMCV infection in vivo［J］. J Virol， 2006， 80(14): 7146-7158.
［6］ Chen N， McCarthy C， Drakesmith H， et al. HIV-1 down-regulates the expression of CD1d via Nef［J］. Eur J Immunol， 2006， 36(2): 278-286.
［7］ Fais F， Tenca C， Cimino G， et al. CD1d expression on B-precursor acute lymphoblastic leukemia subsets with poor prognosis［J］. Leukemia， 2005， 19(4): 551-556.
［8］ Kojo S， Tsutsumi A， Goto D， et al. Low expression levels of soluble CD1d gene in patients with rheumatoid arthritis［J］. J Rheumatol， 2003， 30(12):2524-2528.