作者：江明宏， 舒茂琴， 王倩， 覃跃龙， 李建涛， 曹雪滨
【摘要】 目的: 探讨体外血管平滑肌细胞（VSMC）同步化的培养及意义。方法: 采用组织块贴片法原代培养大鼠胸主动脉VSMC， 利用双胸苷阻断和秋水仙素阻抑法使VSMC达到细胞周期同步化。结果: 经鉴定培养的细胞为VSMC， 采用血清饥饿法、 双胸苷阻断法和秋水仙素阻抑法分别获得了处于不同细胞周期的同步化的VSMC: G0/G1期(89.22±3.54)%， G1/S交界期(66.74±7.16)%， S期(63.24±4.06)%， G2/M期(51.64±11.18)%。结论: 同步了体外培养的VSMC， 为研究冠状动脉粥样硬化的发病机制奠定了实验基础。
【关键词】 血管平滑肌细胞 细胞周期 同步化
血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells， VSMC）的增殖和增生是动脉粥样硬化、 高血压、 冠状动脉腔内成型术术后再狭窄的主要病理表现， 引起VSMC增殖或增生的信号转导机制目前尚不完全清楚， 但揭示VSMC增生或增殖的信号通路具有重要意义， 而增殖信号转导最终的共同通路是细胞周期进展［1］。因此， 研究细胞周期与VSMC之间的关系， 建立有效的能将VSMC同步各个细胞周期阶段， 对于揭示动脉粥样硬化的发病机制具有重要的指导作用。以往一直着力于VSMC增殖方面的研究［2， 3］， 对于VSMC细胞周期同步化， 文献报道采用血清饥饿法同步G0/G1期［4， 5］， 而对于G1/S期、 S期、 G2/M期的同步效果尚未见报道， 我们通过原代培养的大鼠VSMC， 采用胸苷、 秋水仙素同步化， 寻找同步方法的最佳条件， 利用流式细胞术（FCM）测定其同步效果， 分析在不同细胞周期中VSMC的DNA含量情况， 为冠状动脉粥样硬化的发病机制的研究提供实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料 SD雄性大鼠（体质量120～150 g， 共20只）由第三军医大学实验动物研究所提供。DMEM（高糖型）培养基为Gibco公司产品、 胎牛血清购自杭州四季青， 胰酶（Amerisom）、 小鼠抗大鼠α-SM-actin购自武汉博士德公司， FITC标记抗小鼠IgG购自北京中杉公司， 胸苷、 秋水仙素、 DMSO、 MTT试剂均购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠VSMC原代培养及鉴定 (1)大鼠VSMC原代培养: 用1 g/L戊巴比妥钠1.0 mL注入腹腔内， 麻醉SD大鼠， 无菌条件下分离全段胸主动脉血管， 置于含青霉素100 U/mL、 链霉素100 μg/L的无菌高糖DMEM中， 在细胞培养室用眼科镊夹取血管外层组织， DMEM培养基冲洗2遍， 眼科剪把血管剪开， 用棉签把内皮刮掉DMEM(含4 mL/L胎牛血清)清洗2遍， 眼科剪把其组织块剪碎成1 mm×1 mm大小组织块， 用眼科剪把组织块送入50 cm2培养瓶， 用吸管将其均匀分布， 将培养瓶翻转， 另一面加入3 mL DMEM(含200 mL/L胎牛血清)， 3～4 h后翻正， 使组织块完全浸没于组织块中， 静置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱， 5～7 d可见组织块从周围游出， 80%～90%给予传代， 4～6代用于实验。每次取材2只SD大鼠， 总共20只。(2)大鼠VSMC鉴定: 用倒置显微镜观察细胞形态及生长方式。免疫荧光鉴定: 细胞爬片取出后0.01 mol/L PBS(pH7.2)清洗5 min×3次; 用950 mL/L无水乙醇室温下固定20 min， 同上清洗; 100 mL/L正常山羊血清封闭液， 湿盒内温育30 min， PBS清洗; 加1∶100（小鼠抗大鼠α-SM-actin）， 置湿盒内4℃反应过夜， 同上清洗; 最后用1∶100(FITC-抗小鼠IgG)， 湿盒内37℃孵育1 h， 同上清洗; 在荧光显微镜下观察拍照并保存。
1.2.2 大鼠血管平滑肌细胞细胞生长曲线的变化 以103～104/孔接种细胞于96孔培养板中， 按不同分组分别加200 μL含100 mL/L， 血清浓度的培养液， 于培养后第1天至第7天。绘制细胞生长曲线各组分别取3孔进行检测。每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL， 置于恒温细胞培养箱继续培养4 h， 弃培养液， 加入DMSO 150 μL， 振荡10 min， 使结晶物充分溶解， 用酶标仪检测A490值。以天数为横轴， 吸光度为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.2.3 细胞同步化 用双胸苷同步法使细胞同步化于G1/S期和S期［6］: 选取生长良好的细胞， 当其融合率达50%～60%， 首先加入胸苷使培养液的终浓度为2 mmol/L; 16 h后去除含胸苷的培养液， 并用0.01 mol/L， 洗2次， 并加入新鲜的培养液培养18 h; 再次加入胸苷使其终浓度为2 mmol/L， 继续培养14 h; 0.01 mol/L PBS液洗2次后， 此时细胞大多数处于G1/S交界期（2 mmol/L胸苷的培养基可使dTTP上升5倍， DNA复制受阻）。用0.01 mol/L PBS冲洗2遍， 采用新鲜的培养液培养（含100 mL/L胎牛血清） 6 h所获得的细胞主要为S期的细胞。G2/M期细胞的获得: 选取70%～80%生长期的细胞， 换用4 mL/L， 胎牛血清培养24 h， 然后加用秋水仙素100 mg/L（50 cm2培养瓶） 10 μL培养12 h; 静止期细胞的获得: 血清饥饿法， 无血清培养48 h。将上述收集细胞常规消化， 750 mL/L冷乙醇固定， 带入FCM的加样室， 加入等体积碘化丙锭， 以激发光波长488 nm， 测定细胞DNA; 计算机自动作图， 并分析不同细胞周期DNA含量与整个细胞周期总DNA含量的百分比。
1.2.4 统计学处理 各处理组不同细胞周期相的DNA含量的百分比用x±s表示， 采用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析及LSD-t检验。P&<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 VSMC培养及鉴定 倒置显微镜下观察VSMC呈梭形， 束状排列（图1）， 胞质丰富， 核呈圆形或卵圆形， 有1～4个大小不一的核仁， 密度较高时呈“峰-谷”状生长。用α-SM-actin进行免疫荧光化学鉴定， 证实培养的细胞为VSMC（图2）。
图1 VSMC的光镜照片（×100）（略）
图2 VSMC的SMA免疫荧光鉴定（×200）（略）
2.2 VSMC生长曲线 选用细胞活性良好（图3）， 4～6代细胞用于本研究。
图3 VSMC 生长曲线（略）
2.3 VSMC同步化结果 采用血清饥饿法、 双胸苷阻断法和秋水仙素阻抑法分别获得处于不同细胞周期的VSMC: DNA含量百分比， 血清饥饿法以G0G1期为主（P&<0.01）， 提示VSMC主要同步化于静止期; 双胸苷阻断14 h以G0G1期为主(P&<0.01)， 提示VSMC主要同步化于G1/S交界期; 双胸苷阻断14 h后100 mL/L胎牛血清培养6 h以S期为主（P&<0.01）， 提示VSMC主要同步化于S期; 秋水仙素培养12 h 以G2/M期为主（P&<0.01）， 提示VSMC主要同步化于G2/M期（表1）。
表1 评价同步化细胞周期相的各组DNA含量百分比（略）
bP&<0.01 vs其他组.
3 讨论
体外培养细胞的同步化方法有多种， 可根据细胞来源来选用， 但其基本原理相同， 都是使细胞停止在细胞周期的某一时相。目前许多研究工作报道了多种哺乳动物和人体细胞的同步化方法， 但以往同步大多数为肿瘤细胞株［7］， 而对于体外血管平滑肌细胞， 除利用血清饥饿法同步VSMC静止期方法成熟外， 同步其他细胞周期阶段未见文献报道。常用的异亮氨酸营养缺乏法收集G1期细胞， 双胸苷阻断、 羟基脲、 含羞草氨酸可以抑制DNA合成同步G1/S期， DNA聚合酶抑制剂阻止细胞进入S期， 秋水仙素或秋水仙胺阻抑法同步有丝分裂期（G2/M期）。本研究通过双胸苷阻断和秋水仙素阻抑法同步VSMC， 利用FCM测定其同步效果， 为研究冠状动脉粥样硬化的发病机制提供新的实验平台。
在血管平滑肌细胞不同细胞周期中， 包括静止状态和增殖状态， 静止状态中指G0/G1期， 而增殖状态中， 包括G1/S期、 S期、 G2/M期， 其中S期（DNA复制期）是血管VSMC增殖的基本特征， 而G1/S期是DNA复制前期， 是VSMC增殖的起始， G2/M期是有丝分裂期， 同时也是下一个细胞周期的继续。本研究中采用双胸苷阻断法14 h后同步G1/S（DNA合成前期）， 同步效果为（66.74±7.16）%， 双胸苷阻断后利用血清刺激培养6 h后为S期， 同步效果为（63.24±4.06）%， 秋水仙素同步结果为（51.64±11.18）%（正常细胞中含G2/M期细胞为1%～3%）， 血清饥饿法（无血清培养48 h）同步G0期的结果为（89.22±3.54）%， 对于原代血管平滑肌细胞培养， 由于生长时间不一致， 生长不规律， 需注意以下要点: （1）细胞生长状态， 我们所选取的细胞生长曲线活性良好; （2） 选取第1次加入胸苷的细胞生长密度（50%～60%）， 过密或过稀都不能达到此同步化效果; （3）胸苷的浓度适当， 2 mmol/L达到最佳效果， 不影响细胞的生长发育， 同时2 mmol/L胸苷的培养基可使dTTP上升5倍， DNA复制受阻; 第2次加入胸苷的时间， 因生长活性好的VSMC， 生长周期一般为20 h左右， 一般要继续培养S+G2/M期时间（约为14 h）; （4）同步VSMC， 消耗时间长， 采用FCM密切监测其通过G1/S期、 S期进程， 同时最终结果， 需连续重复3次以上实验一致才有一定的意义， 而对于G2/M期， 采用经S期过后， 100 mmol/L胎牛血清刺激后， 流式细胞术监测同步效果一般在20%～30%左右（未列图）。而通过血清饥饿法后， 采用秋水仙素100 mg/L刺激能达到50%以上的效果， 根据实验结果， 相对于细胞株来说， 能够达到实验要求［8］。
VSMC属于增殖潜能的细胞， 其增殖过程受细胞周期的调控， 生理状态下血管平滑肌细胞位于血管中层， 处于静息状态， 在细胞周期中停留在G0/G1期， 为可分化的、 可收缩表型。而在某些情况下， 血管中层的VSMC就会被激活、 开始DNA复制， VSMC转化为合成表型。DNA复制一旦被启动(G1/S期)， 就会继续进入S期、 G2期和M期， 完成一个细胞周期。随着VSMC细胞周期的运行， 分泌大量细胞外基质， 导致血管新生内膜形成及增生， 因此VSMC是再狭窄的主要作用细胞， 也是再狭窄防治研究最重要的靶细胞。本实验中采用细胞周期的同步化， 首次对于体外血管平滑肌培养， 采用胸苷、 秋水仙素同步， 使细胞停留于G1/S期（DNA合成起始转换点）、 S、 G2/M期（有丝分裂诱导转换点）。为进一步研究血管平滑肌细胞增殖调控机制提供依据。
参考文献
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