作者：梁兆端， 曾耀英， 黄秀艳， 贺芳
【摘要】 目的: 研究芹菜素（AP）对小鼠T 细胞体外增殖、 细胞周期和凋亡的影响。方法: 无菌分离小鼠淋巴结和胸腺细胞， MTT 法检测不同浓度（25、 50、 100、 150、 200 μmol/L）的AP 对多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)诱导的T 细胞增殖的影响， PI 染色结合流式细胞术（FCM）分析细胞周期的分布， Annexin V-FITC/PI 双染色结合FCM 检测AP 对T细胞凋亡的影响， 以及AP与地塞米松（DEX）共同作用下T 细胞凋亡的变化， 并用MTT 法检测该药物浓度对T细胞的毒性作用。结果: 25～200 μmol/L AP对T细胞无药物毒性作用， 并明显抑制ConA诱导的T 细胞增殖(P&<0.01)， 使细胞周期停滞在G0/G1期， 且呈剂量依赖关系; 各浓度AP对T细胞凋亡均具有抑制作用， 并明显抑制DEX诱导的T细胞凋亡(P&<0.01)， 且呈剂量依赖关系。结论: 在一定浓度范围内， AP 明显抑制ConA诱导的小鼠T细胞体外增殖， 使细胞周期停滞G0/G1期， 并明显抑制T 细胞凋亡。
【关键词】 芹菜素 T淋巴细胞 增殖 周期 凋亡
［Abstract］ AIM: To study the effect of Apigenin (AP) on the proliferation， cell cycle and apoptosis of mouse T cells in vitro. METHODS: The lymphocytes were prepared from lymph nodes and thymus of mice. The effect of AP on the proliferation of T in response to ConA at different concentrations (25， 50， 100， 150， 200 μmol/L) was detected by MTT. Cell cycle was measured by PI staining and FCM. The effect of Apigenin and Apigenin with DEX on T cell apoptosis was measured by Annexin V-FITC/PI double staining and FCM. The effect of different concentrations of AP cytotoxicity to T cells was measured by MTT. RESULTS: 25-200 μmol/L of AP didn’t have cytotoxicity to T cells， but it had some inhibitory effect on T cells in response to ConA(P&<0.01)， arresting cell cycle at G0/G1 in a dose-dependent manner. Different concentrations of AP inhibited the apoptosis of T cells， especially those induced by DEX(P&<0.01). CONCLUSION: AP can inhibit the proliferation of mouse T cells in response to ConA， arrest cell cycle at G0/G1 and inhibit the apoptosis of T cells.
［Keywords］Apigenin; T lymphocyte; proliferation; cell cycle; apoptosis
芹菜素（Apigenin， AP）， 又名4′， 5， 7-三羟基黄酮， 分子式C15H10O5， 是一种无诱导突变的黄酮类化合物， 也是一种植物雌性激素， 广泛存在于绿色植物中［1， 2］。AP具有抗增殖、 抗炎、 抗病毒微生物和清除自由基等功能， 同时也是信号通路中几种蛋白激酶的抑制剂， 其4′， 5， 7位置的三个羟基和C2C3双键决定了其独特的生物学特性［3-5］。目前， AP广泛应用于肿瘤研究中， 具有抑制多种肿瘤增殖的潜能， 但在免疫学方面的研究罕见报道。目前， 以淋巴细胞增殖、 细胞周期和凋亡为研究靶点， 成为筛选和开发新型免疫调节药物的新策略。在当今开发新型化学药物极为困难的情况下， 从食物提取物中筛选具有免疫调节作用的药物具有很大的空间。
1 材料和方法
1.1 材料 清洁级BALB/c近交系小鼠(雄性， 8~10周龄， 质量22～25 g; 3~4周龄， 质量12～16 g)， 购自广东省医学实验动物中心。刀豆蛋白A(ConA)、 L-谷氨酰胺、 β -二巯基乙醇、 二甲基亚砜(DMSO)、 碘化丙啶（PI）、 地塞米松(DEX)、 噻唑蓝(MTT， 用PBS配制成5 g/L的工作液， -20℃贮存备用)、 芹菜素（AP， 用DMSO溶解成265 mmol/L的储存液， 分装， -20℃保存， 临用前用含100 mL/L DMSO的PBS稀释成10 mmol/L的工作液）和RNase均购自美国Sigma公司。青霉素和链霉素购自华北制药公司。RPMI1640和胎牛血清(fetal calf serum， FCS)购自美国Gibco-BRL公司。Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。无水乙醇购自广州化学试剂厂。FACSCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。
1.2 方法
1.2.1 淋巴结细胞和胸腺细胞的制备 将BALB/c小鼠断髓处死， 无菌分离双侧颌下、 腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅表和肠系膜淋巴结以及胸腺， 去掉被膜， 于200目尼龙网筛研磨过滤， 于4℃， 125 g离心5 min， 并收集细胞， 4℃磷酸盐缓冲液(PBS， pH7.2)洗涤， 同上条件离心1次， 2 mL/L台盼蓝染色， 活细胞百分率达96%， 并用含100 mL/L FCS 的RPMI1640培养液悬浮淋巴细胞并调整淋巴结细胞和胸腺细胞的密度分别为2×109/L和1×109/L。
1.2.2 MTT法检测AP对ConA诱导的小鼠淋巴结T细胞增殖的影响分别设置Control组、 ConA组、 ConA+AP 25μmol/L组、 ConA+AP 50 μmol/L组、 ConA+AP 100 μmol/L组、 ConA+AP 150 μmol/L组和ConA+AP 200 μmol/L组。细胞接种于96孔细胞培养板， 每孔加10 μL不同浓度的AP（终浓度分别为25、 50、 100、 150、 200 μmol/L）， 每一浓度设3个复孔， 每孔定容200 μL， 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱预孵育2 h， 然后加入ConA (终浓度5 mg/L)继续培养。加ConA后48 h， 每孔加入20 μL MTT工作液， 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱孵育4 h， 300 g离心5 min， 吸掉上清液体， 每孔加100 μL DMSO， 振荡10 min， 免疫酶标仪490 nm波长检测吸光度（A值）， 并计算细胞相对抑制率（%）。抑制率=［(1－实验组A均值)/对照组A均值］×100%。
1.2.3 PI染色分析细胞周期分布 按1.2.2的分组及培养方法进行培养， 48 h后收集细胞， 冷PBS洗涤， 于4℃， 125 g离心5 min， 300 μL含100 mL/L普通级小牛血清的PBS重悬， 边轻荡边加入700 μL冷无水乙醇， 4℃固定30 min， 于4℃， 125 g离心5 min， 弃去上清， 2 mL冷PBS重悬洗涤， 同上条件离心2次， 弃去上清， 收集沉淀细胞， 边轻荡边加入300 μL PI染液（含RNase）， 避光15 min， 立即进行FCM分析。
1.2.4 Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡细胞 分别设置Control组、 AP 25 μmol/L组、 AP 50 μmol/L组、 AP 100 μmol/L组、 AP 150 μmol/L组、 AP 200 μmol/L组、 DEX组、 DEX+AP 25 μmol/L组、 DEX+AP 50 μmol/L组、 DEX+AP 100 μmol/L组、 DEX+AP 150 μmol/L组和DEX+AP 200 μmol/L组。胸腺细胞接种于24孔细胞培养板， 每孔加50 μL不同浓度的AP（终浓度分别为25、 50、 100、 150、 200 μmol/L）， 定容1 mL， 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱预孵育2 h， 然后加入DEX (终浓度1 μmol/L)继续培养。6 h后收集细胞， 冷PBS洗涤离心(125 g， 5 min， 4℃)， 弃上清液体， 加入100 μL染料结合缓冲液(Binding buffer)重悬后加10 μL Annexin V-FITC染色， 混匀后室温避光静置15 min， 补加200 μL Binding buffer和5 μL PI 染液（50 mg/L）， 混匀静置5 min， 立即进行FCM分析。
1.2.5 FCM分析 FITC在荧光1(FL1)通道检测， PI在荧光2(FL2)通道检测。先在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中划出淋巴细胞区R1， 然后对R1细胞群作DNA倍体分析， 并对R1细胞群FITC/PI荧光强度进行检测， 每管样品检测10000个细胞。全部数据经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取和分析， 检测周期的数据用ModFit软件进一步分析。
1.2.6 MTT法检测药物毒性作用 分别设置Control组、 AP 25 μmol/L组、 AP 50 μmol/L组、 AP 100 μmol/L组、 AP 150 μmol/L组和AP 200 μmol/L组。淋巴结T细胞接种于96孔细胞培养板， 余下处理同1.2.2（不加ConA）， 并计算细胞相对存活率(%)。存活率=（实验组A均值/对照组A均值）×100%。
1.2.7 统计学处理 获得的结果用x±s表示， n为样本量。统计软件用SPSS.10， 统计方法用one-way ANOVA。
2 结果
2.1 AP对ConA诱导小鼠淋巴结T细胞增殖的影响 如表1所示， 培养48 h， Control 组A值为0.111±0.002， 而ConA组A值明显增加， 为0.850±0.112（P&<0.01）， ConA+AP 25 μmol/L组A值与ConA组无统计学意义（P&>0.05）， 其余各浓度组A值明显低于ConA 组（P&<0.01）， 并具有浓度依赖性。
表1 AP对ConA诱导的T细胞增殖的影响（略）
Tab 1 The influence of Apigenin on the proliferation of T cells in response to ConA
bP&<0.01 vs control; dP&<0.01 vs ConA.
2.2 AP对ConA诱导小鼠淋巴结T 细胞细胞周期阻滞分析 如图1所示， 各组均有晚期凋亡或坏死的细胞， Control组细胞大部分处于G0/G1期， 即为静止状态， ConA组细胞明显进入S 期和G2/M 期（P&< 0.01）， ConA+AP 25 μmol/L组细胞周期分布与ConA组无统计学意义（P&>0.05）， 其余各浓度组细胞周期分布与ConA组均有统计学意义（P&<0.01）， G0/G1期明显增高， 而S期和G2/M期明显降低， 并具有浓度依赖性。
图1 AP对ConA诱导的T细胞细胞周期阻滞分析（略）
Fig 1 The analysis of AP to T cell cycle blockage in response to ConA
a: Control; b: ConA; c: ConA+AP 25μmol/L; d: ConA+AP 50μmol/L; e: ConA+AP 100μmol/L; f: ConA+AP 150μmol/L; g: ConA+AP 200μmol/L.
2.3 AP及AP与DEX共同作用下对胸腺T细胞凋亡影响 Annexin V-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白， 可特异性地与早期凋亡细胞外翻的细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)结合， PI能进入细胞膜不完整的晚期凋亡和坏死的细胞， 故Annexin V-FITC/PI双染色细胞可呈现3个细胞群， 即正常细胞(Annexin V-FITC-/PI-)、 早期凋亡细胞(Annexin V-FITC+/ PI-)、 晚期凋亡和坏死细胞(Annexin V-FITC+/PI+)。如图2所示， 培养6 h， Control组胸腺T细胞自发凋亡率低（7.78%）， 地塞米松(DEX)诱导的胸腺T细胞凋亡率明显增加（63.84%）（P&<0.01）， 各浓度AP明显抑制T细胞自发凋亡， 并对DEX诱导的T细胞凋亡具有明显抑制作用（P&<0.01）。
图2 AP对胸腺T细胞凋亡影响和AP与DEX共同作用下胸腺T细胞凋亡变化（略）
Fig 2 The influence of Apigenin on the apoptosis of thymus T cells and the change of Apigenin with DEX on the apoptosis of thymus T cells
a: Control; b: AP 25 μmol/L; c: AP 50 μmol/L; d: AP 100 μmol/L; e: AP 150 μmol/L; f: AP 200 μmol/L; g: DEX; h: DEX+AP 25 μmol/L; i: DEX+AP 50 μmol/L; j: DEX+AP100 μmol/L; k: DEX+AP 150 μmol/L; l: DEX+AP 200 μmol/L.
2.4 MTT法检测AP对T细胞的药物毒性作用 如表2所示， 25～200 μmol/L AP作用48 h后， 细胞相对存活率大于50%。故培养48 h， 25～200 μmol/L AP对小鼠T细胞无药物毒性作用。
表2 AP对T细胞的药物毒性评价（略）
Tab 2 The value of AP cytotoxicity to T cells
3 讨论
MTT法检测AP对ConA诱导的小鼠淋巴结T细胞增殖影响的结果显示， 在一定浓度范围内（50～200 μmol/L）， AP明显抑制ConA诱导的小鼠淋巴结T细胞的增殖， 具有浓度依赖性， 并与该浓度药物对T细胞的毒性作用无关。PI染色分析细胞周期分布结果表明， AP抑制ConA诱导T 细胞增殖， 并使细胞周期停滞在G0/G1期。上述结果与AP使前列腺癌细胞生长停滞在G0/G1期相似。AP可能促进p53的表达使前列腺癌细胞生长停滞在G0/G1期［2］。p53基因是重要的抑癌基因， 可使细胞分裂停滞在G0/G1期。p53 可以通过促进细胞周期抑制蛋白p21等表达， 抑制异二聚体蛋白激酶（如cyclinD1/CDK4）的活性， 使Rb去磷酸化， 引起细胞周期停滞在G0/G1期［6］。AP抑制ConA诱导的小鼠淋巴结T细胞增殖， 使细胞生长停滞在G0/G1期， 可能与p53途径有关， 其作用机制有待进一步研究。
有研究表明AP通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤细胞增殖［1］， 但本研究Annexin V/PI双染色结果表明， AP抑制胸腺T细胞的自发凋亡， 并抑制DEX诱导的胸腺T细胞凋亡。AP是Ca2+通道阻断剂［7］。研究发现， 胞内自由Ca2+浓度持续升高与凋亡形成有关。线粒体过载Ca2+， 则通过释放凋亡促进因子和产生活性氧族直接诱导细胞凋亡。此外， 高浓度胞内自由Ca2+会引起内质网持续的Ca2+释放， 产生内质网应激， 从而激活凋亡信号而诱导细胞死亡［8］。AP可能抑制胞内自由Ca2+浓度的升高， 从而对胸腺T 细胞具有保护作用。此外， AP是NF-κB、 蛋白激酶C（PKC）、 酪氨酸激酶和有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）等抑制剂［9］， 这些信号分子均与增殖和凋亡信号传导有关。AP可能通过抑制上述信号分子的活性而抑制T 细胞的增殖和凋亡。其确切机制有待下一步的研究。
本研究证明AP对ConA诱导的小鼠T细胞体外增殖具有抑制作用， 使细胞周期停滞在G0/G1期， 并抑制T细胞凋亡， 这将其开发成为免疫调节药物提供了实验基础。
参考文献
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