作者：唐洁， 李柏青， 阮洁， 张林杰
【摘要】 目的: 检测新生儿脐带血CD4+CD25high调节性T细胞（Treg）数量及胞内转录因子Foxp3的表达， 探讨Treg细胞在新生儿期的表达特点。方法: 采集新生儿脐带血（n=15）和成人外周血（n=12）， 密度梯度离心法获取单个核细胞用荧光标记单克隆抗体（mAb）作表面和胞内染色后， 在流式细胞仪上检测CD4+CD25highTreg细胞的数量及其胞内转录因子Foxp3的表达。结果: 脐带血Treg细胞占CD3+CD4+T细胞的比例（3.86%±1.63%）明显高于成人外周血（0.87%±0.74%， P&<0.01); 而脐带血Treg细胞中表达Foxp3的比例明显低于外周血Treg细胞（23.21%±8.9% vs 71.3%±11.6%， P&<0.01）。结论: 虽然新生儿脐带血CD4+CD25highTreg细胞数量明显高于成人外周血， 但Foxp3+细胞数量明显低于成年人， 提示在功能上可能尚未成熟。
【关键词】 调节性T细胞 转录因子 新生儿脐带血
［Abstract］ AIM: To investigate the amount of CD4+CD25high Treg cells and the expression of Foxp3 in neonatal cord blood， and to analyze the expression of Treg cells in neonates. METHODS: The mononuclear cells from cord blood or peripheral blood were isolated from neonatal cord blood (n=15) or healthy adult’s peripheral blood (n=12) by density gradient centrifugation. Then they were stained with fluorescence labeled monoclonal antibodies for cell surface and intracellular protein. The amount of CD4+CD25high Treg cells and intercellular transcription factor Foxp3 were measured by flow cytometry. RESULTS: The amount of CD4+CD25high Treg cells in CD3+CD4+ T cells in cord blood was significantly higher than that in adult’s peripheral blood (3.86%±1.63% vs 0.87%±0.74%， P&<0.01)， whereas the expression of Foxp3 in CD4+CD25high Treg cells in cord blood was markedly lower than in adult’s blood (23.21%±8.9% vs 71.3%±11.6%， P&<0.01). CONCLUSION: The low expression of Foxp3 in CD4+CD25high Treg cells in cord blood suggests Treg cells in neonates are not mature in suppression.
［Keywords］Regulatory T cell; transcription factor; neonate cord blood
1995年， Sakaguchi等［1］发现正常人外周血及脾脏的CD4+T细胞中存在着一类调节性T细胞， 特征性高表达IL-2受体a链（CD25分子）， 这种CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell， Treg细胞）在免疫应答的负调节及维持机体内环境稳定和诱导机体免疫耐受中发挥着重要作用。其后有研究结果显示在成人外周血中仅CD4+CD25high Treg细胞具有抑制功能［2］。近几年来， 许多研究表明转录因子Foxp3（forkhead box p3， Scurfin）在CD4+CD25highTreg细胞的发育和功能维持上发挥着重要作用［3， 4］。但目前对Treg细胞的发生、 发育、 成熟及其功能的分子机制尚不清楚。为了解Treg细胞生长发育特点， 我们采用流式细胞术对新生儿脐带血和成人外周血中CD4+CD25highTreg细胞数量及胞内转录因子Foxp3进行测定， 初步探讨Treg细胞在新生儿期的表达特点。
1 材料和方法
1.1 材料 流式细胞仪（FACSCalibur）为BD公司产品; 低温离心机（Eppendorf 5810R）为德国产品; 培养基（RPMI1640）为Gibco公司产品; 新生小牛血清(NBS)为杭州四季青生物公司产品; 淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque， 比重1.077±0.002）为中国医学科学院生物工程研究所产品; 多聚甲醛、 皂素（Saponin）均为Sigma公司产品; 抗人Foxp3-FITC单克隆抗体（mAb）购自BioLegend公司; 抗人CD3-APC mAb、 抗人CD25-PE mAb及抗人CD4-PeCy5.5 mAb及相应荧光标记的小鼠同型对照均购自Invitrogen-Caltag公司。新生儿脐带血采自蚌埠医学院第二附属医院和蚌埠市中心医院妇产科足月健康新生儿， 其中男婴8例， 女婴7例。胎儿娩出后立即从胎盘脐静脉穿刺采血放入肝素钠抗凝管。成人外周血来自本校12例健康教职工和学生， 其中男6例， 女6例，年龄20~35岁。所有血样标本均在采样后4 h内送达实验室。
1.2 方法
1.2.1 脐血和成人外周血单个核细胞的制备 常规密度梯度离心法分离脐血和成人外周血单个核细胞， 用含50 mL/L NBS-50 mL/L人自体血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为1×109/L。
1.2.2 荧光抗体染色 取上述制备的细胞悬液加入流式管， 每管3×105个细胞(300 μL); 用染色缓冲液（PBS， pH7.2， 含50 mL/L NBS和1 g/L NaN3）1 500 r/min， 5 min洗1次， 离心后弃上清; 利用残留液体（≤30 μL/管）重悬细胞后， 加抗人CD3-APC、抗人CD25-PE和抗人CD4-PeCy5.5作细胞表面染色4℃ 30 min; 加染色缓冲液1 mL/管， 洗2次; 用20 g/L PFA 500 μL/管， 于4℃固定30 min; 离心后弃上清; 用染色缓冲液1 mL/管， 洗2次弃上清; 加透膜缓冲液（PBS， pH7.2， 含1 g/L Saponin， 100 mL/L NBS和1 g/L NaN3） 500 μL/管， 4℃ 15 min; 1 700 r/min， 7 min离心后弃上清（使残留细胞悬液≤50 μL/管）；加入抗人Foxp3-FITC染色， 4℃ 30 min; 透膜缓冲液1 mL/管， 洗1次；染色缓冲液1 mL/管， 洗1次; 加10 g/L PFA 300 μL， 流式细胞术检测。同样处理的细胞设置未加荧光抗体对照管、 仅作表面染色的用3种荧光抗体（不染胞内Foxp3）对照管， 用小鼠IgG1-FITC作胞内染色的同型对照管， 以及分别用抗CD3-FITC、 抗CD4-PE、 抗CD3-PeCy5.5或抗CD3-APC作单色荧光抗体染色作为调试流式细胞仪荧光补偿管。
1.2.3 流式细胞术检测胞内转录因子数据获取及分析 在流式细胞仪上用Cellquest软件检测待检样品， 利用未染色管和单色荧光抗体染色管设置PMT电压和荧光补偿， 利用同型对照管区分是否有非特异性染色， 利用不染胞内阴性对照管设置阴阳性界限， 然后对待测样品进行检测。每管测定获取105个细胞的数据。在用Cellquest软件分析结果时， 首先在前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)点阵图上划定淋巴细胞区域R1， 然后在FL-4（CD3APC）和FL-3（CD4 PeCy5.5）点阵图上划定CD3+CD4+细胞区域为R2， 在FL-3（CD4 PeCy5.5）和FL-2（CD25 PE）点阵图上划定CD25high为R3， CD25int为R4， CD25-为R5， 然后分别设门G3（R1*R2*R3）， G4（R1*R2*R4）， G5（R1*R2*R5）， 在直方图上检测分析不同细胞亚群的胞内转录因子Foxp3的表达。
1.2.4 统计学处理 同一组数据以x±s表示， 不同组之间的数据差异用t检验作比较。
2 结果
2.1 脐带血和成人外周血CD4+CD25highTreg细胞的比例 新生儿脐带血CD4+T细胞中CD25阳性和阴性细胞分界明显， 形成两个不同群体， 而成年人外周血中CD4+T细胞中CD25阳性和阴性细胞分界不明显， 呈过渡型（图1）。对CD25阳性细胞再根据表达强度分为高表达（CD25high）和低/中度表达（CD25int）， 通常将CD4+CD25high细胞作为Treg细胞， 则发现脐带血CD4+CD25highTreg细胞占CD3+CD4+T细胞的比例（3.86±1.63）%明显高于成人外周血CD4+CD25highTreg细胞（0.87±0.74）% (P&<0.01， 表1)。
表1 脐带血和成人外周血CD4+T细胞各亚群比例及其Foxp3的表达（略）
Tab 1 CD3+CD4+ T cell subsets and the expression of Foxp3 in neonatal cord blood and adult’s peripheral blood
aP&<0.05， bP&<0.01 vs cord blood.
2.2 转录因子Foxp3在脐带血和成人外周血CD4+CD25highTreg细胞中的表达 新生儿脐带血CD4+CD25highTreg细胞中表达Foxp3的细胞比例（23.21±8.90）%明显低于成人外周血CD4+CD25highTreg细胞中的比例（71.30±11.60）%（P&<0.01）; 而脐带血CD4+CD25int细胞中表达Foxp3的细胞比例（9.06±5.20）%， 也低于成人外周血CD4+CD25int细胞中的比例（15.99±6.90）%（P&<0.05， 图1）。
图1 脐带血和成人外周血中CD4+CD25highTreg细胞Foxp3表达的流式细胞术分析（略）
Fig 1 FCM analysis of the expression of Foxp3 in CD4+CD25high T cells in cord blood and adult’s peripheral blood
A: Cord blood; B: Adult’s peripheral blood
2.3 Foxp3的表达与CD25荧光强度呈正相关 我们将CD4+CD25+细胞按CD25荧光强度由高到低划分为2%、 2%~4%、4%~6%、 6%~8%和8%~10% 5组， 使每组细胞数占CD4+CD25+细胞的2%， 对其表达Foxp3的比例进行比较发现， 脐带血和成人外周血Foxp3的表达均与CD25荧光强度呈正相关， 且在各组成人外周血Foxp3的表达均高于脐带血（图2）。
图2 脐血和成人外周血CD4+CD25+细胞中CD25分子与Foxp3表达（略）
Fig 2 The expression of CD25 and Foxp3 in CD4+CD25+ T cells in cord blood and adult’s peripheral blood
3 讨论
CD4+CD25+Treg细胞组成性高表达CD25分子（IL-2受体a链）、 CD152（CTLA-4）、 CD122、 Neuropilin-1（Nrp-1）［5］、 GITR（TNFRSF-18）［6］等， 但这些分子在活化的CD4+效应T细胞上也有表达， 因此缺乏特异性。由Foxp3基因编码的具有插头螺旋结构的转录因子Foxp3高表达在CD4+CD25+Treg细胞中， 在CD8+ T细胞和CD4+CD25-T细胞中少量表达［7］。尽管目前对Foxp3是Treg细胞的特异性标志的观点仍存在争议， 但许多研究证实Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞发育和发挥免疫抑制功能的关键因子。本研究结果显示， CD25highT细胞高表达Foxp3（在成人外周血约有71%）， 而CD25intT细胞仅部分表达（在成人外周血约有16%）， 在CD25-T细胞仅少量表达（在成人外周血约有1%）， 因此我们认为CD4+Treg细胞中CD4+CD25highTreg细胞是发挥免疫调节功能的主要细胞。
在本实验中， 流式细胞术结果显示新生儿脐带血CD4+T细胞中CD25阳性和阴性细胞明显形成两个群体， 而成年人外周血CD4+T细胞中CD25阳性和阴性细胞显示为一个连续的细胞群。此外， 在脐带血CD4+CD25high与CD4+CD25intT细胞之间也有清晰的分界， 且在数量上明显多于成人外周血（4% vs 1%）， 这与其他研究者的报道相同［8］。但我们通过检测细胞胞内Foxp3表达发现数量上占优势的脐带血CD4+CD25high细胞表达Foxp3比例却远远低于成人外周血。另外我们把脐带血和成人外周血CD4+CD25+细胞按CD25荧光强度由高到低分为5组进行比较发现在各组脐带血Foxp3表达均低于后者。究其原因可能与新生儿脐带血细胞是很少受到抗原刺激的初始T细胞， 仅少量发育成熟有关。尽管在胎儿胸腺一部分CD4+细胞被高亲和力的自身MHC/肽复合体以阴性选择的方式活化且表达CD25分子， 但其必须在外周通过抗原的再刺激才能逐渐获得抑制功能［9］。因此， 我们认为Foxp3可以作为CD4+Treg细胞功能成熟的特异性标志。脐带血CD4+CD25highTreg细胞低表达Foxp3， 提示在功能上可能尚未成熟。实验中我们还发现随着CD25荧光强度增加， Foxp3表达百分比亦增加。我们推测这可能与IL-2信号转导有关， IL-2/IL-2R相互作用促进了Foxp3的上调和CD25分子的表达［10］， 其具体机制有待进一步研究。
如何将幼稚且易于分离的脐带血CD4+CD25high Treg细胞的功能诱导成熟无疑对治疗自身免疫病、 变态反应性疾病及抑制同种异体移植排斥等临床应用具有重要意义。
致谢: 感谢蚌埠市中心医院妇产科医护人员提供新生儿脐带血标本。
参考文献
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