作者：李淑珍， 刘莹， 陈苗， 柳晓兰， 唐小波， 高建恩， 朱大岭， 孙启鸿
【摘要】 目的: 制备分泌型的磷脂酶A2 G13（group XIII secreted phospholipase A2， PLA2G13）的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）， 并对抗体进行特性鉴定。方法: 以人正常肝cDNA文库为模板， 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-PLA2G13（即PLA2G13-GST）和pET-32a-PLA2G13（即PLA2G13-His）。PLA2G13-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb和鼠mAb。采用Western blot鉴定兔抗人PLA2G13 pAb的特异性。采用Western blot和Immunohistochemistry鉴定鼠抗人PLA2G13 mAb的特异性。结果: PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白在均大肠杆菌中以包涵体形式大量表达。Western blot鉴定表明， 兔抗人PLA2G13 pAb可特异地识别HepG2细胞系中相对分子质量（Mr）约19700的蛋白， 与文献报道中PLA2G13的实际Mr相符。通过筛选共获得8株可稳定分泌抗PLA2G13的杂交瘤细胞株， Western blot鉴定表明6株可识别重组人PLA2G13蛋白， 免疫组织化学鉴定显示2株可特异性识别正常肝组织中的PLA2G13蛋白。结论: 成功地制备了抗人PLA2G13兔pAb和鼠mAb， 为进一步研究PLA2G13的功能提供了特异性检测工具。
【关键词】 PLA2G13 原核表达 融合蛋白 抗体制备
分泌型的磷脂酶A2 G13（group XIII secreted phospholipase A2， PLA2G13）是分泌型磷脂酶家族的成员之一， 基因定位于10q22.1， 包含195个氨基酸， 相对分子质量（Mr）约21400， 主要存在于细胞外基质， 成熟型PLA2G13 Mr约19700， 其结构特征类似于磷脂酶家族另一个成员PLA2G12， 但二者的组织分布呈现很大差别［1］。RNA blots结果展示PLA2G13基因在成人肝脏， 小肠中表达， 而在肾脏中则呈现较低水平的表达。生理条件下， 分泌型磷脂酶家族参与炎症反应、 宿主防御反应和动脉粥样硬化等生物学过程。其家族成员多具有磷脂酶活性， 而PLA2G13在其活性位点由亮氨酸突变为组氨酸， 因此不具有磷脂酶活性。近年来的基因水平研究和蛋白芯片研究结果均显示PLA2G13在肝癌和肝硬化发生时基因和蛋白水平上调［2］。但是目前， PLA2G13基因在肝癌发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。我们主要从构建重组表达载体入手， 获得其融合表达蛋白后， 免疫新西兰雄性大耳白兔和 BALB/c小鼠， 制备抗PLA2G13的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）， 并对抗体进行特性鉴定， 为进一步研究PLA2G13的功能及其在肝癌的发生， 发展及治疗中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 成人肝cDNA文库购自Clonetech公司。大肠杆菌BL21感受态菌株为本实验室自制。pGEX-4T-1和pET-32a为Amersham公司产品。限制性内切酶EcoR I和Xho I、 ExTaq酶、 T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒， 质粒提取试剂盒购自Omega Biotek公司。BALB/c小鼠和新西兰雄性大耳白兔购自军事医学科学院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室制备。Hbt小鼠mAb分型试剂盒购自HyCult biotechnology b.v. 公司。鼠抗GST标签mAb、 HRP-羊抗鼠IgG、 HRP-羊抗兔 IgG、 ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 PLA2G13抗原的制备和纯化 根据Human Protein Reference Database中提供的PLA2G13的氨基酸序列， 并结合应用生物信息学软件DNAstar的表位分析， 综合设计引物。在其上游引物设计EcoR I酶切位点， 下游引物设计Xho I酶切位点， 片段全长297个碱基， 以人正常肝cDNA文库为模板进行PCR反应。回收扩增目的片段， 并将目的片段及pGEX-4T-1和pET-32a载体分别经EcoR I和Xho I双酶切并连接， 转化入大肠杆菌， 阳性克隆经测序正确后抽提质粒， 进行诱导表达。PLA2G13在BL21细菌中以包涵体形式表达， 收集蛋白并进行纯化。
1.2.2 PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白的Western blot分析 将重组菌菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后， 电转移至PVDF膜上。经50 g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h后， 分别加入1∶2000稀释的鼠抗GST mAb和鼠抗His mAb， 室温下孵育2 h， TBST缓冲液洗膜后， 加入HRP-羊抗鼠IgG抗体（1∶5000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。
1.2.3 兔抗人PLA2G13 pAb的制备 将纯化的PLA2G13融合蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分混合后， 每只家兔皮下多点免疫融合蛋白400 μg; 4周后第2次免疫， 5周后耳缘静脉采血检测抗体效价。7周后颈动脉采血， 分离血清， 分装后置-20℃保存。
1.2.4 兔抗人PLA2G13 pAb的特性鉴定 (1)ELISA检测抗血清效价: ELISA检测板用PLA2G13-His融合蛋白以1 mg/L的浓度包被。按梯度稀释抗血清每孔加入100 μL( 阴性对照为正常兔血清， 空白对照为TBST)， 37℃孵育30 min洗涤3次后， 加入1∶6000稀释的HRP-羊抗兔IgG， 37℃孵育30 min洗涤3次后进行TMB显色。(2)Western blot检测兔抗人PLA2G13 pAb: 重组菌菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后， 将蛋白质转移至PVDF膜上。封闭液封闭后， 加入兔抗人PLA2G13 pAb与膜上的蛋白进行抗原-抗体反应后， 用HRP-羊抗兔IgG进行检测， ECL显色， 至目的条带显色清晰时终止反应。(3)兔抗人PLA2G13 pAb在肝癌细胞中的鉴定: 抽提HepG2总蛋白， 经SDS-PAGE凝胶电泳后， 电转移至PVDF膜上。经50 g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h后， 加入按1∶5000稀释的兔抗人PLA2G13 pAb， 室温下孵育1 h， TBST洗3次后， 加入1∶10000稀释的HRP-羊抗兔IgG， 室温下孵育45 min， TBST洗3次后进行ECL显色。阴性对照中设正常兔血清为一抗， 空白对照中为TBST为一抗。
1.2.5 鼠抗人PLA2G13 mAb的制备 实验动物为BALB/c小鼠， 6～8周龄， 质量17～21 g。第1次免疫时， 将PLA2G13-GST融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合， 免疫3只小鼠， 每只小鼠经皮下多点注射抗原80 μg。4周后进行第2次免疫， 抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合， 每只小鼠经皮下多点注射抗原40 μg。第2次免疫后7 d， 经尾静脉采血， 用ELISA法测定血清抗体的效价。选择抗体效价高的小鼠， 于融合前3 d， 在尾静脉注射PLA2G13-GST40 μg进行加强免疫。取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0细胞按常规方法融合。用间接ELISA法筛选， 有限稀释法克隆化， 并按常规方法制备mAb腹水。
1.2.6 鼠抗人PLA2G13 mAb的特性鉴定 Western blot检测mAb: PLA2G13-GST和PLA2G13-His重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后， 电转至PVDF膜上， 用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h， 然后加入杂交瘤细胞培养上清， 4℃孵育过夜， TBST缓冲液洗膜后， 加入羊抗鼠IgG-HRP抗体（1∶7500稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。阴性对照中设正常鼠血清作为一抗， 阳性对照中融合鼠血清为一抗。(2)Immunohistochemistry鉴定鼠mAb在正常成人肝组织中的反应: 丙酮固定的冰冻成人肝组织切片用PBST浸洗5 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin(屏蔽体内的生物素) 50 mL， 室温孵育15 min， 滴加30 mL/L h3O2－甲醇， 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭30 min， 加入鼠抗人PLA2G13杂交瘤细胞培养上清， 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗鼠IgG-HRP， 37℃孵育30 min， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 返蓝后封片。
2 结果
2.1 PLA2G13融合蛋白的表达与鉴定 经IPTG诱导后， PLA2G13-GST和PLA2G13-His在大肠杆菌BL21中大量表达， Mr分别为38000和32000， 与预测的PLA2G13融合蛋白的Mr相一致， 表达量约占菌体总蛋白的50%～60%， 融合蛋白主要以包涵体的形式表达（图1）。通过Western blot检测， 应用抗GST和抗His的抗体能够在相应位置分别检测到PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白（图2）。
图1 PLA2G13融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析（略）
1: 阴性对照（大肠杆菌BL21裂解蛋白）; 2: 大肠杆菌BL21中表达的PLA2G13-His融合蛋白; 3: 大肠杆菌BL21中表达的PLA2G13-GST融合蛋白.
图2 PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白的Western blot分析（略）
1: 阳性对照（GST标签蛋白）; 2: PLA2G13-GST融合蛋白; 3: 阳性对照（His标签蛋白）; 4: PLA2G13-His融合蛋白.
2.2 兔抗人PLA2G13 pAb的特性鉴定 ELISA检测板用PLA2G13-His 融合蛋白以1 mg/L的浓度包被。间接法检测抗体的效价为1∶512000。用兔抗人PLA2G13 pAb对融合蛋白进行Western blot实验， 证实在Mr约38000和32000处各有一特异性的条带， 说明此pAb可以特异性识别重组PLA2G13蛋白。Western blot分析显示兔抗人PLA2G13 pAb可以在HepG2细胞总蛋白中检测到Mr为19700蛋白， 这与文献报道的PLA2G13的Mr一致， 在Mr为62000~64000处也有一清晰条带， 于其无活性形式蛋白Mr相符。阴性对照（兔免疫前血清代替一抗）在相应位置无条带（图3）。
2.3 杂交瘤细胞株的建立及抗体亚类的测定 (1)经细胞融合、 筛选及克隆化， 获得8株能稳定分泌抗PLA2G13 mAb的杂交瘤细胞株（AE093、 BA071、 BG091、 CE073、 DB082、 DE061、 EC051和EG071）。(2)抗体亚类的测定结果显示， mAb均为IgG类。
图3 兔抗人PLA2G13 pAb特异性的Western blot鉴定（略）
1: 阴性对照（大肠杆菌BL21裂解蛋白）; 2: PLA2G13-His融合蛋白; 3: PLA2G13-GST融合蛋白; 4: HepG2细胞总蛋白.
2.4 mAb的特异性鉴定 (1)Western blot显示: 杂交瘤AE093、 BA071、 CE073、 DB082、 EC051和EG071的培养上清能同时检测到重组的PLA2G13-GST和PLA2G13-His蛋白（图4）， 表明这6株mAb可特异性识别重组PLA2G13蛋白; (2)Immunohistochemistry检测: 取正常成人肝组织冰冻切片进行免疫组化检测。只有杂交瘤AE093、 CE073、 EC051的培养上清能识别切片中相应抗原。抗原呈颗粒状分布， 仅见于肝细胞， 汇管区各结构均阴性（图5）。
图4 抗PLA2G13 mAb特异性的Western blot鉴定（AE093）（略）
1: 阴性对照（GST标签蛋白）; 2: PLA2G13-His融合蛋白; 3: PLA2G13-GST融合蛋白.
图5 PLA2G13蛋白在人正常肝脏组织中的免疫组织化学定位（×200）（略）
A: 阴性对照（正常鼠血清）; B: 杂交瘤细胞株AE093培养上清.
3 讨论
PLA2G13基因定位于人类染色体10q22.1， 编码195个氨基酸的钙离子结合蛋白［3］， 隶属于分泌型磷脂酶家族， 成熟型PLA2G13 Mr约19700， 其结构特征与磷脂酶家族另一个成员PLA2G12相似， 但二者的组织分布呈现很大差别。Rouault 等［4］的RNA blots研究结果展示PLA2G13基因在成人肝脏， 小肠中均有表达， 同时在肾脏中呈现较低水平的表达。生理条件下， PLA2G13参与脂质转运、 细胞与细胞间相互作用和细胞间信号转导等生物学过程［5， 6］。分泌型磷脂酶家族成员多具有磷脂酶活性［7］， 而PLA2G13在其活性位点由亮氨酸突变为组氨酸， 因此其磷脂酶活性丧失。PLA2G13亦不能与分泌型磷脂酶家族的传统M型受体结合［8］， Rouault 等［4］证明并鉴定了32种与PLA2G13表达相关的基因， 其中包括TRA1、 TLOC1和ANXA7。这些基因的上调显示了在肿瘤细胞中蛋白质运输活力的增强， 更为有趣的是他们发现7种与PLA2G13相关的基因， 可分别编码过氧化物酶， 解毒素酶和参与氧化应激反应的一些酶类， 提示了PLA2G13可能参与这些生物进程。近年来的基因水平研究和蛋白芯片研究结果均显示PLA2G13在肝癌和肝硬化发生时基因和蛋白水平上调， 但PLA2G13在一些组织的肿瘤发生时表达减少， 提示了在肿瘤发生时可能作为一个基因抑制物来发挥作用［5］。Smith等［2］通过基因芯片的方法发现PLA2G13在60%~70%的肿瘤病例中均显示基因上调变化， 且这种变化在肝癌和肝硬化病例中尤为显著， 因此PLA2G13可能是一种潜在的肝癌的血清学的特异性标记物， 有望成为临床治疗肝癌这一恶性肿瘤的新基因靶点。但是目前， PLA2G13基因在肝癌发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。
本研究中， 我们利用原核表达系统，表达了PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白， 并以PLA2G13-GST为免疫原， 用带有不同标签的PLA2G13-His为检测原， 免疫动物成功制备了抗PLA2G13 pAb和8株可稳定分泌抗PLA2G13的杂交瘤细胞株， 其均为IgG类。对制备的pAb和mAb进行了特异性分析， 实验结果显示免疫兔血清中产生了抗PLA2G13和GST的抗体， 可特异识别重组表达的PLA2G13蛋白， 并可特异识别肝癌细胞系HepG2中的PLA2G13蛋白; 8株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株中， mAb AE093、 BA071、 CE073、 DB082、 EC051、 EG071在Western blot检测中能特异性识别重组的PLA2G13蛋白， mAb AE093、 CE073、 EC051可用于免疫组织化学检测正常肝组织中表达的PLA2G13蛋白， 其主要定位于细胞质中。由于抗PLA2G13 pAb和mAb对PLA2G13均具有很好的识别特性， 因此为进一步研究PLA2G13在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制提供了必要的工具。
参考文献
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