作者：白龙梅， 李学忠， 张志琳， 刘春风
【摘要】 目的: 通过胚胎中脑祖细胞(MPC)体外培养获得高纯度的多巴胺神经元培养体系。方法: 取自E12鼠胚中脑腹侧的MPC悬液在添加bFGF的DMEM/F12/N2/L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐(AA-2P)培养液中扩增培养， 5 d后停用bFGF， 促进细胞分化， 4 d后通过Neurobasal/阿糖胞苷(Ara-c)抑制胶质细胞生长， 获得纯神经元， 使用TH鉴定细胞， 计数细胞比例和纯度， β-tubulin III鉴定成熟神经元， 并计数细胞比例和纯度。结果: 在添加了bFGF 20 μg/L的DMEM/F12/N2/AA-2P培养液中MPC增殖良好， 体外培养7 d后细胞数量扩增到培养前的(16.54±1.25)倍; 使用Neurobasal/阿糖胞苷后胶质细胞受抑制， 神经元占94%以上， 其中多巴胺(DA)能神经元的比例约(35.56±4.13)% 。结论: E12鼠胚MPC原代培养合并使用阿糖胞苷是获取高纯度DA能神经元培养体系的可靠途径。
【关键词】 中脑前体细胞 多巴胺能神经元 细胞培养
为探讨帕金森病的发病机制及治疗方法， 常需在单细胞水平了解黑质多巴胺能神经元的生理生化特性及其对各种毒物、 药物的反应。因此， 高纯度、 高质量、 稳定地进行原代黑质多巴胺能神经元培养， 是进行这一领域研究的关键技术。我们应用大鼠胚胎中脑祖细胞(mesencephalic progenitor cells， MPC)体外培养技术， 旨在能够获得较高纯度及较高质量的原代黑质多巴胺能神经元培养体系。
1 材料和方法
1.1 材料 E12 Sprague-Dawley孕鼠由苏州大学动物中心提供; DMEM/F12培养液、 无血清培养添加剂N2、 胎牛血清(FBS)、 25 g/L胰酶消化液均购自Gibco公司; 碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)、 L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐（L-ascroid acid-2-phosphate Sesquimagnesium Salt， AA-2P）、 阿糖胞苷（arabinosylcytosin， Ara-c）均购自Sigma公司; 兔抗酪氨酸羟化酶（TH）单克隆抗体（mAb）购自Novus公司（编号300-109) ; 小鼠抗β-Tubulin Ⅲ mAb购自Chemicon公司; 免疫组化试剂盒购自Boster公司; 抗小鼠cy2免疫荧光染色试剂盒、 抗兔cy3免疫荧光染色试剂盒和Hoechst 33258免疫荧光染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及绘制生长曲线 MPC的培养参照Yu等［1， 2］方法并适当修改， 简述如下， E12孕鼠以乙醚麻醉后腹部消毒， 剖腹取出子宫置于10 cm的消毒玻璃培养皿中; 剪开子宫取出胚囊， 用镊子撕破羊膜囊取出长约6～8 mm(顶臀径)的胚胎， 置入另一盛有D-Hanks液的玻璃皿中; 在解剖显微镜下切取中脑曲， 切开中脑导水管腹侧， 切取中央约0.5mm×0.6mm×0.4mm的中脑腹侧部分， 置入约含0.5mL取材液（2∶1的DMEM/F12、 2 g/L碳酸氢钠、 20 g/L B27、 10 g/L N2、 0.2 g/L DNase）的1.5 mL的EP管中， 分别用1 mL和0.2 mL的枪头反复吹吸15次; 静置3 min， 去除沉淀， 依胚胎数量加入1～5 mL培养液（2∶1的DMEM/F12、 2 g/L碳酸氢钠、 20 g/L B27、 10 g/L N2、 10 mL/L FBS、 20 μg/L bFGF、 100 μmol/L AA-2P）， 玻璃移液管吹吸分散悬浮细胞。取10 μL细胞悬液加入10 μL4 g/L台盼蓝溶液， 充分混匀后倒置显微镜下计数并判定活细胞比例; 调整细胞悬液密度至3×108/L， 部分接种在预先用多聚赖氨酸包被的25 cm2培养瓶中， 每个培养瓶中加人3 mL细胞悬液。部分接种在用多聚赖氨酸包被的2个24孔培养板中， 其中1个24孔板放置用多聚赖氨酸包被的玻璃爬片， 另一个不放， 每孔中加入500 μL细胞悬液， 37℃、 50 mL/L CO2细胞培养箱中培养24 h， 细胞贴壁后吸除全部培养液， 重新加入无血清培养液（2∶1的DMEM/F12、 2 g/L碳酸氢钠、 10 g/L N2、 20 μg/L bFGF、 100 μmol/L AA-2P）继续培养， 隔天更换半量培养液。细胞培养5 d 后吸除全部培养液， 换培养液（Neurobasal、 20 g/L B27、 10 mL/L FBS、 100 μmol/L AA-2P、 9 g/L谷胺酰胺）， 隔天更换半量培养液继续培养4 d。接种在培养板中的细胞爬片在第5、 7、 9天取出分别用于免疫组化、 免疫荧光鉴定。接种在24孔板中的细胞在第2、 4、 7、 9天接种分别随机取6孔， 加入25 g/L胰酶消化， 吹打成单细胞悬液， 台盼蓝计数， 计算平均每孔细胞数并记录， 绘制原代培养细胞生长曲线。在培养瓶中细胞于第10天换液， 并加入终浓度为7 μmol/L的阿糖胞苷， 培养2天后吸除培养液后加人3 mL D-Hanks液漂洗2次后加入12.5 g/L胰酶， 倒置显微镜下观察细胞分散悬浮情况， 约8～10 min后加人100 mL/L FBS终止消化: 继续用玻璃移液管吹吸分散细胞， 细胞悬液收集人1.5 mL EP管中， 4℃下1500 r/min离心3 min; 弃去上清液， 加入培养液（Neurobasal、 20 g/L B27、 50 mL/L FBS、 50 mL/L马血清、 100 μmol/L AA-2P、 9 g/L谷胺酰胺）调整细胞悬液密度至2×108/L， 在放置用多聚赖氨包被的玻璃爬片24孔板中培养， 隔天更换半量培养液， 第3天取含培养细胞的盖玻片经40 g/L多聚甲醛固定后行免疫荧光染色。
1.2.2 免疫荧光染色 免疫荧光染色参照文献［3］的方法。简要操作步骤如下: 细胞爬片或冰冻切片用PBS冲洗5 min×3; 加入37℃预热的含40 g/L多聚甲醛固定10 min; PBS漂洗3次， 加入50g/L BSA和Triton X-100的0.01mol/L PBS， 室温下置1 h， 加入一抗孵育2 h， 一抗分别为兔抗TH mAb（1∶2000）、 小鼠抗β-Tubulin Ⅲ mAb（1∶1000）; PBS漂洗3次， 加入二抗孵育1 h， 二抗分别为抗兔Cy3(1∶300)、 抗小鼠Cy2(1∶300); PBS漂洗3次后封片， 荧光显微镜下观察、 拍照片。免疫荧光双标结合Hoechst衬染指的是在一抗孵育的过程中同时加入上述2种一抗， 浓度同前， 孵育时间同前， 并在二抗孵育后的PBS漂洗后， 加入1∶1000稀释的Hocehst 33258孵育2 min复染细胞核， 然后再继续PBS漂洗3次后封片。阴性对照用MPBS代替特异性一抗， 阳性对照采用雄性350 g左右的Sprague-Dawley大鼠的中脑黑质冰冻切片， 其他步骤同上。荧光显微镜下观察并分类计数细胞。荧光显微镜使用铬滤片， Cy3激发波长554 nm， 发射波长570 nm; Cy2激发波长495 nm， 发射波长525 nm; Hocehst 33258激发波长354 nm， 发射波长454 nm。
2 结果
2.1 E12鼠胚MPC体外生长的形态学的观察 体外培养第1天培养细胞呈比较均匀的单个分散或数个聚集的贴壁生长， 细胞周围有较强的折光性; 48 h后即可形成集落状贴壁生长的细胞团; 随着培养时间的延长细胞团直径进一步增大， 3～4 d后可形成肉眼可见细胞团。4～5 d细胞团边缘可见大量长突起， 少量细胞从细胞团内向外迁移， 这些具有长突起的细胞形态相对成熟; 6～7 d时当培养液中撤去bFGF后， 从神经球向外迁移的细胞明显增多， 细胞形态进一步成熟(图1)。联合使用Neurobasal和Ara-c后， 细胞生长受到抑制， 胞体呈多边形的胶质细胞皱缩， 悬浮， 换液后多为胞体椭圆的神经元细胞。
2.2 E12鼠胚MPC细胞体外生长增殖能力的观察 MPC接种后部分细胞死亡， 第2天细胞数轻度下降， 随后迅速升高， 培养1周后细胞数量达到培养前的(16.54±1.25) 倍(n=6)， 随后增长速度放缓， 9 d后， 细胞数量为培养前的(21.35±2.03) 倍。
2.3 E12鼠胚MPC细胞体外培养后分化能力的观察及其鉴定 细胞培养后的第2、 6、 10、 12天后， 应用Cy3(红色)、 Cy2（绿色）加Hoechst(蓝色)复染细胞核的免疫荧光标记技术定性观察培养细胞。结果显示， 细胞培养的第2天， TH阳性细胞不明显， 第6天阳性细胞主要出现在细胞团块中， 并且细胞突起明显。神经球内部以及神经球之间的多巴胺神经元形成广泛突触联系。TH阳性神经元的比例与神经球的大小有关， 神经球越大， 阳性细胞的比例相对越高。第10天， TH阳性神经元的数量继续增多， 且有大量细胞开始向外迁移（图2）。在高倍视野下随机选取5个视野， 以Hoechst标记的细胞核数代表细胞总数， β-Tubulin Ⅲ阳性细胞数代表成熟神经元数， TH阳性细胞数代表多巴胺神经元数， 取其5个视野的平均数作为该爬片的实际细胞数， 随机抽取5个爬片。结果显示β-Tubulin Ⅲ阳性细胞占总细胞的(49.53±2.34)%， TH阳性细胞占总细胞的(26.76±2.36)%。第12天， 使用Ara-c抑制胶质细胞生长后， 神经元数量有所下降， 但不明显， 胶质细胞绝大多数消失， 神经元比例达(94±7.32)%， 其中多巴胺神经元占总细胞数的(35.56±4.13)%（图3）。
图1 从神经球向外迁移的细胞 (×400)（略）
图2 免疫荧光(cy3标记-红色荧光)显示大量神经元从神经球中外迁(×100) （略）
图3 免疫荧光双标结合Hoechst衬染的多巴胺神经元(×400)（略）
3 讨论
来自胚胎不同部位的神经前体细胞经体外培养后细胞分化有明显的区域特异性， 来自中脑和间脑的神经前体细胞有更高的TH抗原阳性细胞分化率， 细胞形态也更接近于中脑DA能神经元［4］。我们选择E12胎龄鼠胚作为实验对象， 收集中脑腹侧细胞进行体外培养。bFGF是促进有丝分裂的小蛋白分子或多肽类物质， 具有促进神经元存活和生长发育作用。当bFGF浓度达到10～20 μg/L时， 细胞增殖达较高水平， 之后随着bFGF浓度增加， 细胞增殖速度反而下降。bFGF有促进早期胚胎MPC增殖的能力， bFGF促进MPC增殖有2个高峰， 第1个高峰是神经元增殖高峰， 出现在原代培养的前5 d， 6～9 d主要促进胶质细胞的增殖。抗坏血酸(AA)是人体生长和发育必需的营养素， 最近研究表明其也有诱导中脑前体细胞分化为DA能神经元的作用。Lee等［5］发现一定剂量的AA单独也能诱导神经干细胞分化为DA能神经元。其机制可能是通过上调中脑前体细胞内EPO和BMP7的表达来介导DA能神经元的诱导分化。我们所用的AA-2P是一种性状更加稳定的AA衍生物。在bFGF和AA-2P作用下， E12鼠胚中脑腹侧细胞体外培养4 d后能增殖形成肉眼可见的细胞簇， MPC扩增培养7 d后， 细胞数量大约增加到培养前的(16.54±1.25)倍， 9 d后， 细胞数量为培养前的(21.35±2.03)倍。10 d后培养细胞中TH 阳性细胞约占细胞总数的(26.76±2.36)%。体外扩增培养第3天开始细胞簇之间和细胞簇的边缘有一些贴壁生长、 具有长突起的形态相对成熟的细胞， 随时间延长呈逐渐增多的趋势; 培养液中撤去bFGF后， 更多的细胞从细胞簇向外迁出、 分化。
考虑到Neurobasal主要有利于神经元的生长、 增殖， 对胶质细胞生长起抑制作用， 但不能促使胶质细胞凋亡。抑制细胞有丝分裂的药物Ara-c可迅速作用分裂的神经胶质细胞， 使之抑制或死亡， 主要被胶质细胞摄取， 引起胶质细胞凋亡， 但也有部分被神经元摄取， 导致神经元凋亡， 且随时间和剂量呈正相关， 因此我们在神经胶质细胞增殖的高峰期短期内加入Ara-c。试验结果显示二者合用培养2 d， 细胞总数下降到原来的(54.65±3.38)%， 胶质细胞绝大多数消失， 神经元比例达94%以上， 其中多巴胺神经元占总细胞数的(35.56±4.13)%。
综上所述， 我们认为E12鼠胚MPC在包含有bFGF和AA-2P的培养液中扩增良好， 该培养液不仅能明显增加细胞数量， 同时也能提高培养细胞向DA能神经元的分化比例。联合使用Neurobasal和Ara-c可明显降低胶质细胞的含量， 神经元的比例上升到94%以上， 多巴胺神经元的比例更是达到了(35.56±4.13)%， 提示E12鼠胚MPC原代培养， 联合使用bFGF和AA-2P， 合并使用Ara-c是建立高纯度DA能神经元培养体系可靠途径。
参考文献
［1］ Yu DH， Lee KH， Lee JY， et al. Changes of gene expression during neuronal differentiation of central nervous system precursors treated with ascorbic acid［J］. J Neurosci Res， 2004， 78(1): 29-37.
［2］ Zhang W， Qin LY， Wang TG， et al. 3-Hydroxymorphinan is neurotrophic to dopaminergic neurons and is also neuroprotective against LPS-induced neurotoxicity［J］. FASEB J， 2005， 19(4): 395-397.
［3］ Salthun-Lassalle B， Hirsch EC， Wolfart J， et al. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels［J］. J Neurosci， 2004， 24(26): 5922-5930.
［4］ Horiguchi S， Takahashi J， Kishi Y， et al. Neural precursor cells derived from human embryonic brain retain regional specificity［J］. J Neurosci Res， 2004， 75(6): 817-824.
［5］ Lee JY， Koh HC， Chang MY， et al. Erythropoietin and bone morphogenetic protein-mediate ascorbate-induced dopaminergic differentiation from embryonic mesencephalic precursors［J］. Neuroreport， 2003， 14(10): 1401-1404.