作者：范淑英， 高义军， 刘静宜， 梁维敏
【摘要】 目的: 米非司酮用于子宫肌瘤治疗效果较好， 但目前机制不明， 本研究中探讨米非司酮治疗子宫肌瘤的可能机制。 方法: 获取手术组织标本和分离子宫肌瘤细胞， 采用Western blot方法研究雌激素受体（ER）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）的表达水平， 采用RNA干扰方法研究ER表达沉默后VEGFR的表达改变， 采用MTT法研究米非司酮对子宫肌瘤细胞的生长抑制作用。 结果: 子宫肌瘤组织中ER及VEGFR的表达水平明显高于肌瘤周围正常子宫肌组织， 差异具有统计学意义， 并且肌瘤组织中ER和VEGFR的表达有正相关性。 RNA干扰方法沉默子宫肌瘤细胞中ER表达后VEGFR的表达水平降低。 米非司酮对VEGFR表达水平较高的子宫肌瘤细胞具有较强的生长抑制作用， 而且经米非司酮作用后子宫肌瘤细胞的PR、 ER和VEGFR表达水平降低。 结论: 米非司酮可能通过ER、 PR和VEGFR途径发挥抑制子宫肌瘤生长的作用。
【关键词】 米非司酮 子宫肿瘤 VEGFR ER
虽然子宫肌瘤一般并不会产生致命性的并发症， 但对一些症状比较严重的患者仍缺乏非常理想的治疗手段。 子宫肌瘤的确切病因不明， 可能与体内雌激素受体（estrogen receptor， ER）水平过高， 长期受雌激素刺激有关。 目前的药物治疗虽能缓解临床症状， 但常会产生一些副作用。 因此， 需要不断寻找新的治疗药物满足患者对疾病治疗和生活质量的双重需求［1］。 米非司酮是用于妊娠早期流产的一种药物， 作用于孕激素受体（progesterone receptor， PR）， 但近年来在中国被用于治疗子宫肌瘤等疾病。 米非司酮治疗子宫肌瘤效果好， 副作用少， 复发率低，但作用机制还不清楚， 因此要对其安全性进行评估， 降低潜在用药风险。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是与子宫肌瘤生长密切相关的生长因子， 子宫肌瘤组织中的VEGF受体（vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR）表达水平高于正常子宫肌层中的表达水平。 子宫肌瘤中高水平的VEGFR表达有利于肌瘤的进一步生长［2］。 本研究中我们主要观察米非司酮对肌瘤组织中ER、 PR、 VEGFR的影响， 探讨米非司酮抑制子宫肌瘤生长的机制。
1 材料和方法
1.1 材料 抗PR［鼠抗人单克降抗体(mAb)IgG］、 ER（α）（兔抗人mAb IgG）、 一抗及相应二抗（羊抗兔、 羊抗鼠IgG）购自北京中衫金桥生物技术有限公司; VEGFR（VEGFR-2）、 兔抗人多抗IgG购自美国Santa Cruz公司; 二抗（羊抗兔IgG）购自北京中衫金桥生物技术有限公司。22例子宫肌瘤标本分别取自因患子宫肌瘤行全子宫切除术或子宫肌瘤剜除术的未绝经妇女， 排除其他并存疾病。 年龄29～50岁， 平均38.0±5.4岁。 其选择的病例均为处于月经周期的分泌期， 肌瘤分类为肌壁间13例， 浆膜下5例， 黏膜下2例。 手术前均未接受米非司酮及性激素治疗。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 取子宫肌瘤（经术后病理结果证实）组织1 cm3 ， 迅速低温运输至细胞培养室， 剪碎成1 mm3的小块， 胶原酶热消化后， 细胞悬液离心沉淀接种， 细胞附壁单层生长至80%融合状态后进行传代。 每例细胞传2～3代。
1.2.2 米非司酮对子宫肌瘤细胞的生长抑制作用 取分离传代后的细胞5×105接种培养皿， 加入2 μmol/L的米非司酮作用48 h后， 加入5 g/L MTT 100 μL孵育4 h， 加入150 μL DMSO溶解蓝紫色沉淀， 用酶标仪读取吸光度， 观察其对细胞生长的抑制率。 同时设立不加米非司酮的对照组， 将各实验组与对照组相比较后得到米非司酮对各子宫肌瘤细胞的生长抑制率: (对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。
1.2.3 Western blot检测 常规方法收集组织和细胞总蛋白， 进行SDS-PAGE电泳， 转膜后50 g/L脱脂奶封闭。 分别用相应一抗室温孵育2 h; PBS洗3次， 每次5 min; 然后以相应种属二抗孵育1 h; 最后用化学发光法进行曝光显影。
1.2.4 RNA干扰 选择ERα的干扰靶序列5′-CCGCTGGAGAGCAACTGCAT-3′［3］由上海吉凯基因生物技术有限公司化学合成双链干扰RNA， 用Lipofectamine 2000转染入分离培养的子宫肌瘤细胞。 同时用无关序列（由吉凯基因生物技术有限公司提供）转染作为阴性对照。 转染6 h后更换血清， 继续培养48 h后收集细胞， 提取总蛋白， 用Western blot方法进行蛋白表达分析。
2 结果
2.1 瘤组织和瘤周正常组织VEGFR表达 22例子宫肌瘤患者的肌瘤组织及相应患者的肌瘤周围正常子宫肌组织， Western blot结果发现22例中的16例VEGFR的表达水平高于相应配对的正常子宫肌组织， 差异具有统计学意义（P&<0.05）。 配对样本的Western blot结果（图1）。
2.2 子宫肌瘤组织中VEGFR表达水平与ER表达水平的关系选择4例具有不同VEGFR表达水平的子宫肌瘤组织， 用Western blot方法研究其ER表达水平。 结果发现VEGFR表达水平较高的组织中的ER表达水平也较高， 反之亦然（图2）。 经灰度扫描定量分析， 结果表明ER与VEGFR的表达水平具有相关性（相关系数0.87）。
图1 子宫肌瘤组织与子宫正常肌组织中VEGFR表达差异（略）
M: 子宫肌瘤组织; N: 子宫正常肌组织.
图2 子宫肌瘤组织中ER与VEGFR的蛋白表达具有正相关性（略）
1-4: 表示4例子宫肌瘤组织.
2.3 VEGFR表达水平与ER表达水平的因果关系 分离子宫肌瘤组织的瘤细胞， 进行体外培养， 采用RNA干扰方法， 应用特定RNA靶序列沉默ER mRNA表达， 观察VEGFR表达水平的改变。 结果显示， ER基因表达沉默后VEGFR蛋白的表达水平明显下降（图3）。 经灰度扫描分析RNA干扰使ER表达水平下降70%， VEGFR蛋白表达水平下降85%。
图3 RNA干扰沉默ER表达后VEGFR表达水平下降（略）
2.4 米非司酮对表达不同水平VEGFR的子宫肌瘤细胞生长的影响 分离子宫肌瘤细胞进行体外培养， MTT法观察发现米非司酮对VEGFR表达水平较高的子宫肌瘤细胞具有较强的生长抑制作用（图4A）。 而且， 经2 μmol/L米非司酮作用48 h后， Western blot检测显示细胞中PR、 ER和VEGFR的蛋白表达水平明显下降（图4B）。
3 讨论
子宫肌瘤是女性生殖系统最常见的良性肿瘤。 虽然子宫肌瘤一般并不会产生致命性的并发症， 但有些子宫肌瘤则会产生较严重的症状。有些肌瘤增长迅速或绝经后仍继续增大， 由硬变软， 尚有恶变的可能。子宫肌瘤的确切病因不明， 可能与体内雌激素水平过高， 长期受雌激素刺激有关。 在高雌激素环境中， 如妊娠、外源性高雌激素等情况下生长明显， 而绝经后肌瘤逐渐缩小。肌瘤包膜中布有放射状血管支， 以供给肌瘤血液营养。 肌瘤越大， 血管越粗， 数目也越多。 提示子宫肌瘤的发生及临床症状也可能与血管的过度增生有关。 而子宫肌瘤中血管内皮生长因子受体VEGFR的表达水平成为影响其血管密度的重要因素。 我们通过直接分析子宫肌瘤组织中VEGFR的表达发现， 子宫肌瘤中VEGFR的表达水平高于同患者来源的肌瘤旁正常子宫肌组织， 并且差异具有统计学意义。 这进一步证明了VEGFR在子宫肌瘤发展中可能发挥着重要的作用。
图4 米非司酮对子宫肌瘤细胞的影响（略）
A: 米非司酮对表达不同水平VEGFR子宫肌瘤细胞生长的抑制作用， 横轴1-4分别为图2中的4例对应编号的子宫肌瘤组织分离得到的原代细胞; B: 米非司酮降低子宫肌瘤细胞中PR、 ER、 VEGFR的蛋白表达水平.
本研究中，我们发现米非司酮能抑制分泌期子宫肌瘤PR和ER的表达。 已有研究报道米非司酮缩小子宫肌瘤的同时能抑制子宫肌瘤PR mRNA及其蛋白的表达水平， 认为米非司酮减小子宫肌瘤体积的作用除直接作用于PR外还可能与其抑制PR基因的表达有关。 还同时发现米非司酮对PR基因在转录水平表达的影响是可逆的， 但对蛋白水平的影响会维持较长时间［4］ 。 另一项研究也表明， 米非司酮能特异地下调子宫肌瘤组织内ER和PR表达水平， 但并不影响正常子宫肌层内ER和PR的表达［5］。 VEGF/VEGFR信号系统是ER作用的另一个重要通路。 Gargett等［6］的研究表明雌激素能上调VEGFR的表达， 而孕激素并没有这种作用。 这一反应能被雌激素的拮抗药ICI182，780阻断。 雌激素增加了子宫内膜微血管内皮细胞中VEGFR的表达， 从而促进内皮细胞增殖， 并且发现该作用主要是通过ER-alpha介导的。 目前未见米非司酮与VEGFR关系的报道， 本研究中发现米非司酮治疗后抑制子宫肌瘤细胞生长， 同时降低ER和VEGFR的表达水平。 进一步通过RNA干扰的方法沉默ER表达后发现VEGFR表达水平降低， 这既与ER调控VEGFR表达的观点是一致的， 也提示VEGFR在米非司酮抑制子宫肌瘤生长的过程中可能发挥着重要的作用。
综合我们的研究结果和先前的研究报道， 我们推测米非司酮治疗子宫肌瘤的机制可能是米非司酮竞争抑制孕激素作用， 下调子宫肌瘤组织中ER、PR表达水平， 进一步下调EGF/EGFR和VEGF/VEGFR信号系统的作用， 子宫肌瘤细胞增殖、血管生长受到抑制， 子宫肌瘤缩小。 这一模型综合了现有对ER、 PR和VEGFR信号通路的研究结果， 结合我们研究中发现的米非司酮治疗与VEGFR变化的关系， 较好地在机制上解释了米非司酮治疗子宫肌瘤过程中发生的相关分子改变和生理变化， 可能对未来临床应用米非司酮治疗子宫肌瘤产生理论指导作用， 规范病例选择及用药方案。
参考文献
［1］ 王 敏. 米非司酮治疗子宫肌瘤30例临床观察［J］. 中华现代妇产科学杂志， 2005， 2(2): 58-60.
［2］ Nakayama T， Cho YC， Mine Y， et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors VEGFR-1 and 2 in gastrointestinal stromal tumors， leiomyomas and schwannomas［J］. World J Gastroenterol， 2006， 12(38): 6182-6187.
［3］ Musatov S， Chen W， Pfaff DW， et al. RNAi-mediated silencing of estrogen receptor {alpha} in the ventromedial nucleus of hypothalamus abolishes female sexual behaviors［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103(27): 10456-10460.
［4］ 杨 彦， 陈亚梅， 王胜军. 短期大剂量米非司酮口服对子宫肌瘤雌孕激素受体的影响［J］. 江苏大学学报， 2003， 13(1): 4-5.
［5］ 王惠群， 勒家玉. 米非司酮对子宫肌瘤及子宫肌层组织雌、 孕激素受体的影响［J］. 中华妇产科杂志， 2000， 35(2): 79-81.
［6］ Gargett CE， Zaitseva M， Bucak K， et al. 17β-estradiol up-regulates vascular endothelial growth factor receptor-2 expression in human myometrial microvascular endothelial cells: role of estrogen receptor-alpha and -beta［J］. J Clin Endocrinol Metab， 2002， 87(9): 4341-4349.