作者：独军政， 高闪电， 常惠芸， 丛国正， 林彤， 邵军军， 刘湘涛， 才学鹏
【摘要】 目的: 克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因， 利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段， 纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法: 利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因， 将其与pGEM T-easy载体相连构建pGEM/β3LBD， 经BamH Ⅰ/Xho Ⅰ酶切后回收β3LBD片段， 与同样酶切处理的原核表达载体pGEX 4T-1相连， 构建原核表达质粒pGEX/β3LBD， 将其转化感受态细胞BL21(DE3)， 以IPTG诱导表达β3LBD蛋白。纯化目的蛋白后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果: 猪β3亚基的LBD基因含有507个核苷酸， 编码169个氨基酸， 猪β3 LBD基因与牛、 人、 黑猩猩、 猕猴、 马、 犬、 挪威大鼠、 家鼠、 和鸡的β3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90.3%、 92.3%、 92.1%、 91.3%、 90.5%、 90.3%、 87.8%、 85.2%、 79.5%。哺乳动物的β3亚基LBD基因同源性较高， 与鸡的同源性较低。实现了重组猪β3 LBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达， SDS-PAGE显示其相对分子质量（Mr）约为44 000， 制备的兔多克隆抗体效价达1∶12800以上。结论: 实现了猪FMDV受体β3 LBD的基因克隆、 原核表达和多克隆抗体的制备， 为深入研究受体β3亚基在FMDV感染过程中的作用机制奠定了基础。
【关键词】 FMDV病毒受体 猪β3LBD基因 原核表达 多克隆抗体
［Abstract］ AIM: To clone and express the ligand binding domain (LBD) cDNA of porcine integrin β3 as foot-and-mouth disease virus (FMDV) receptor and prepare its polyclonal antibody. METHODS: The LBD cDNA of porcine β3 was obtained from the lung tissue of pig infected with FMDV by RT-PCR， and the recombinant plasmid pGEM/β3LBD was constructed. After digested with BamH Ⅰ/Xho Ⅰ， the β3LBD fragment was subcloned into prokaryotic expression vector pGEX 4T-1. The recombinant expression plasmid pGEX/β3LBD was constructed and transformed into E.coli BL21(DE3). The recombinant porcine β3LBD protein was expressed after IPTG induction and purified from total protein of BL21(DE3). The rabbits from New Zealand were immunized with the purified fusion protein to prepare polyclonal antibody， which was identified by Western blot and ELISA. RESULTS: The 507 bp cDNA of porcine β3LBD encoded a polypeptide of 169 amino acids. The similarity of nucleotide sequence β3LBD between pigs and cattle， human being， chimpanzees， rhesus monkeys， horses， dogs， Norway rats， mice， chickens was 90.3%， 92.3%， 92.1%， 91.3%， 90.5%， 90.3%， 87.8%， 85.2%， 79.5%， respectively. The β3LBD gene of mammals exhibited high sequence homology. The recombinant β3LBD protein was expressed efficiently as inclusion body after IPTG induction and was approximately 44 000. The titer of the polyclonal antibody against the purified β3LBD protein was about 1∶12800 by ELISA. CONCLUSION: The gene cloning and expression of β3LBD and the preparation of its polyclonal antibody lay a foundation for further research into the interaction of FMDV with β3 subunit of porcine integrin.
［Keywords］FMDV receptor; ligand binding domain cDNA of porcine β3; prokaryotic expression; polyclonal antibody
病毒感染宿主细胞的第一个步骤是病毒与受体结合， 在受体的介导下病毒粒子才能进入细胞内。已经发现的口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease， FMDV）受体分为Ⅱ类: 整联蛋白（integrin）和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate proteoglycans， HSPG）［1］。口蹄疫田间分离毒株仅利用整联蛋白作为受体， 而口蹄疫细胞适应毒株则除了利用整联蛋白外， 还可利用HSPG作为受体。许多实验表明， HSPG对FMDV来说可能是一种替换受体， 或是该病毒感染进入细胞的一种旁路途径［2］。整联蛋白可与含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Giy-Asp， RGD）基序的蛋白配体结合， 而RGD基序在FMDV VP1的G-H环中高度保守， 这是整联蛋白成为FMDV受体的分子基础。1995年， Berinstein等［3］发现人源玻连蛋白（vitronectin）受体αvβ3的抗血清和αvβ3的单克隆抗体（mAb）均能阻断FMDV对易感细胞的感染， 由此认为αvβ3是该病毒的细胞受体。这是第一个被发现的FMDV 受体。αv和β3亚基均有自己特异的配体结合域（ligand-binding domain， LBD）， 可与病毒配体相互作用。研究表明， β3亚基胞外域中的169个氨基酸参与构成了LBD［4］。虽然体外实验证明FMDV可以利用人整联蛋白作为受体进入细胞， 但在自然条件下这种病毒并不引起人类的疾病， 为了阐明FMDV与自然宿主猪的相互作用关系， 继制备了牛αvLBD多克隆抗体后［5］， 本试验首次从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆到了β3亚基LBD基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析， 实现了重组猪β3LBD的高效表达并制备了兔多克隆抗体， 这为深入揭示猪αvβ3受体在FMDV感染过程中的作用机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 FMDV实验感染猪肺组织、 大肠杆菌菌株DH5α和BL21（DE3）、 原核表达载体pGEX 4T-1均由家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存; RNA提取试剂盒购自Qiagen公司; 限制性核酸内切酶、 IPTG、 X-gal、 DNA marker、 DNA片段纯化试剂盒、 one step RT-PCR试剂盒均购自宝生物（大连）公司; T4连接酶为Promega公司产品; 低分子量蛋白标准购自中国科学院上海细胞生化所; 溶菌酶、 弗氏佐剂均为Sigma公司产品; 硝酸纤维素（NC）膜、 透析袋为Pharmacia公司产品; HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 其他试剂均为国产或进口分析纯。健康新西兰大白兔（3月龄， 雄性， 体质量约2 kg）由兰州兽医研究所实验动物场提供。
1.2 方法
1.2.1 引物 参考GenBank中不同动物来源的β3基因序列设计2条引物: P1: 5′-GTGGGATCCCCCCAGCGGATCTTGCTCCG3′; P2: 5′-CGACTCGAGCTTGGCATCGGCGGTAAACA-3′， 这对引物用于扩增猪β3亚基的LBD基因， 预期大小约500 bp。P1和P2引物的5′端分别引入了酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ， 用于构建原核表达质粒。
1.2.2 RNA提取与RT-PCR 将猪肺组织置于液氮预冷的研钵中， 研磨至无肉眼可见颗粒， 期间不断加入少量液氮， 参考RNA提取试剂盒操作说明提取细胞总RNA。按试剂盒说明进行RT-PCR反应， PCR产物经10 g/L琼脂糖电泳观察结果。
1.2.3 基因克隆与序列分析 将纯化的PCR产物和pGEM T-easy载体进行连接、 转化， 小剂量制备质粒， PCR、 酶切鉴定后将初步确定为阳性的重组质粒pGEM-β3LBD送上海生工生物工程公司测序。重组质粒序列测定后， 借助DNAstar、 BioEdit、 Mega3.1等生物学软件对所测序列与参考序列比较分析。参考基因及GenBank登录号为: 牛β3(AF239959)、 人β3（J02703）、 猕猴β3(XM001116013 )、 犬β3(AF116270)、 家鼠β3(BC125518)、 挪威大鼠β3(NM153720)、 马β3（NM001081802）、 黑猩猩（XM523684）、 鸡β3（NM204315）。
1.2.4 重组表达质粒的构建和表达 重组质粒pGEM-β3LBD经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后， 回收β3LBD片段， 与同样酶切处理的pGEX 4T-1载体连接， 转化大肠杆菌DH5α， 随机挑取单个菌落小剂量制备质粒， PCR、 酶切、 测序鉴定， 将测序正确的重组质粒pGEX/β3LBD转化大肠杆菌BL21(DE3)， 挑取单菌落接入10 mL LB/Ampr 培养液中， 37℃振摇培养过夜， 次日按1∶100将菌液接入LB/Ampr培养液， 37℃振摇培养2~4 h至A600值达到0.3~0.5时， 加IPTG至终浓度1 mmol/L， 继续培养4～6 h后进行SDS-PAGE分析目的蛋白的诱导表达情况。
1.2.5 蛋白纯化及其多克隆抗体的制备 将诱导表达的菌体收集后， 离心收集沉淀， 加入超声缓冲液冰上间歇超声， 离心弃上清， 重复上述步骤3～4次。沉淀加适量上样缓冲液， 重悬后沸水煮5 min后上样， 电泳结束后用预冷的0.1 mol/L KCl 浸泡胶至显示出乳白色的蛋白条带， 切下目的条带放入透析袋内， 用水平电泳洗脱装置洗脱目的蛋白， 取样进行SDS-PAGE电泳。以纯化的β3LBD蛋白免疫3月龄雄性新西兰大白兔。初次免疫用500 μg重组蛋白， 与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀后于背部皮下多点注射。4周后第1次加强免疫用250 μg重组蛋白， 与等体积的不完全弗氏佐剂混匀后于背部皮下多点注射。之后隔2周加强免疫1次， 并于2次加强免疫后第10天经心脏大量采血， 按常规方法分离制备血清。以ELISA方法和Western blot分析确定抗体的效价和特异性。
2 结果
2.1 RT-PCR扩增 提取猪肺组织的细胞总RNA后， 反转录得到cDNA， PCR扩增得到大小约500 bp的目的条带（图1）。将凝胶纯化的PCR产物与pGEM T-easy载体16℃连接12 h后， 转化JM109， 挑取白色单个菌落制备质粒， 经PCR、 酶切鉴定片段大小与预期结果相符。
图1 猪β3 LBD基因的RT-PCR结果（略）
Fig 1 RT-PCR results of porcine β3 LBD RNA
1: PCR products; 2: DL 2000 marker.
2.2 序列分析 测序结果表明， 猪β3亚基LBD基因含有507个核苷酸， 编码169个氨基酸。猪β3 LBD基因与牛、 人、 黑猩猩、 猕猴、 马、 犬、 挪威大鼠、 家鼠、 鸡的β3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90.3%、 92.3%、 92.1%、 91.3%、 90.5%、 90.3%、 87.8%、 85.2%、 79.5%， 推导的氨基酸序列同源性分别为92.3%、 92.9%、 92.9%、 92.3%、 92.3%、 92.9%、 91.7%、 91.7%、 85.8%。不同物种来源的β3亚基LBD的氨基酸序列比较发现， 在20～37、 60～76、 128～142、 151～169位区域的氨基酸高度保守。利用β3亚基LBD序列绘制遗传进化树发现， 偶蹄动物（牛与猪）β3亚基LBD位于同一分支， 遗传关系较近， 二者与灵长类、 啮齿类动物的β3亚基LBD遗传关系较远， 与禽类最远。
2.3 原核表达载体的构建 重组质粒pGEM-β3LBD经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后， 回收β3LBD片段， 将该片段克隆至pGEX 4T-1原核表达载体， PCR、 酶切结果显示目的片段与预期大小一致， 测序结果显示重组质粒pGEX/β3LBD含有正确的开放阅读框。
2.4 重组蛋白的表达和纯化 将重组质粒pGEX/β3LBD转化大肠杆菌BL21(DE3)， 以IPTG诱导表达重组β3LBD蛋白。SDS-PAGE分析表明， 重组菌经IPTG诱导后在44000处可看到一条特异的蛋白条带， 本试验以载体pGEX4T-1表达的重组蛋白为融合蛋白， 在Nh3-末端带有Mr为26000 的GST标签， β3LBD蛋白实际的Mr为 18000， 与预期表达的目的蛋白大小一致。细菌沉淀经裂解超声获得其包涵体， 包涵体经切胶纯化后， 获得了纯度更高的重组蛋白（图2）， 经分光光度计测得其浓度为1.12 g/L。
2.5 多克隆抗体的鉴定 以β3LBD蛋白为抗原3次免疫新西兰大白兔分离收集血清。用制备的兔抗血清进行Western blot分析， 结果显示兔抗血清与表达菌体中的重组蛋白形成了特异的抗原抗体反应带， 而与pGEX 4T-1空载体表达的重组GST表达产物无反应。以2 mg/L的重组蛋白包板， 间接ELISA法测定兔抗血清效价为1∶12800以上。
图2 表达产物的SDS-PAGE（略）
Fig 2 SDS-PAGE of recombinant protein
1: Expressed products induced by IPTG for 5 h; 2: Negative control; M: Protein marker; 3: Inclusion bodies; 4: Purified protein.
3 讨论
整联蛋白是细胞膜表面一类重要的细胞黏附分子， 不仅介导细胞与细胞之间、 细胞与细胞外基质之间的相互作用， 并作为信号受体在细胞的生长、 移行、 增殖和分化等生理过程中发挥重要作用， 而且还作为受体参与了病毒的感染过程［6， 7］。研究表明， 许多病毒如FMDV、 人疱疹病毒、 腺病毒、 轮状病毒、 人乳头瘤病毒16型、 艾博拉病毒、 柯萨奇病毒A9、 埃可病毒1、 2、 9、 22型、 人免疫缺陷病毒等， 均可利用整联蛋白分子作为病毒受体或辅受体（co-receptor）进入各自的宿主细胞。目前已经发现18种α亚单位和8种β亚单位， 共组成24种异源二聚体［7］。在这24种αβ复合物中， αvβ1、 αvβ3、 αvβ6、 αvβ8、 αvβ5、 α5β1、 α8β1、 αⅡbβ38种整联蛋白能够识别RGD序列而与其配体相互作用， 已被实验证实前4种是FMDV的受体［3， 8］。β3亚基参与组成两种异源二聚体: αⅡbβ3（CD41/CD61）和αvβ3（CD51/CD61)。通过晶体结构和EM结构分析， 表明αvβ3存在2种构象， 即活性构象和非活性构象［9］。2种构象可相互转换， 并受Ca2+和Mn2+离子的动态调节。Mn2+离子存在时， αvβ3被激活， 分子伸展， 其头部顶端的配体结合位点暴露而PSI结构域（包括了β3亚基氨基端1-53 aa）被隐蔽起来。Ca2+存在时αvβ3活性被抑制， 分子卷曲， 头部折向细胞表面， 此时β亚基的PSI结构域被呈现到分子顶端。
整联蛋白的α和β亚基通过Nh3一末端相互结合形成的球形区域为细胞外LBD， 其余部分形成棒状跨膜区。整联蛋白象一座桥梁介导了细胞内外之间的双向信息传递。一方面， 整联蛋白通过LBD与细胞外配体结合把胞外信号传入细胞内， 导致细胞骨架重组、 基因表达和细胞分化， 这是由外向内的信号过程; 另一方面， 来自细胞内的信号也能经过整联蛋白转导， 从而调节整联蛋白与配体的亲和力， 这是由内至外的信号过程［10］。由此可见， 整联蛋白的LBD在细胞信号转导过程中扮演重要角色。整联蛋白作为FMDV受体在病毒感染细胞过程中引发何种信号转导途径目前尚无证据。本研究选择以β3的LBD为研究切入点， 首次从FMDV感染猪的肺组织中克隆到了β3亚基的LBD基因并对其序列进行了比较分析。从遗传进化树看， 口蹄疫自然宿主猪与牛β3亚基LBD的遗传关系最近。口蹄疫自然条件下仅感染偶蹄动物的特性是否与动物种群间受体的差异有直接关系呢？ 这有待深入研究。
FMDV具有严格的宿主范围， 自然条件下其感染对象是猪、 牛、 羊及其他家养和野生偶蹄动物［11］， 但FMDV受体的发现均是以人源整联蛋白基因进行受体重建实验的。毫无疑问， 开展FMDV自然宿主的受体研究将更加有利于病毒的致病机制和宿主嗜性的研究。Neff 等［12］对人和牛的αvβ3整联蛋白亚单位的序列进行了比较， 发现人和牛的αv亚单位氨基酸序列同源性为98.8%， 而β3的同源性仅有93%。他们将编码αv和β3 亚基的cDNA转染K562和CHO细胞后， 这2种FMDV非允许细胞对病毒的感染性大大提高， 且牛αvβ3介导病毒感染的能力比人αvβ3更强， 这说明FMDV的宿主范围在一定程度上与它结合自然宿主整联蛋白受体的能力有关。同时， 研究发现αvβ3整联蛋白是吸附受体， 其介导的感染对αv或β3亚基胞内结构域的缺失并不敏感， 推测可能还有其他的细胞表面分子作为共受体， 在病毒内化过程中发挥作用［13］。至今还未见猪FMDV受体β3亚基的相关研究报道。目前， 市面上没有商品化的抗猪β3蛋白的抗体可以利用， 这大大限制了人们对猪β3蛋白作为FMDV受体的相关研究。本研究中首次制备的兔抗猪β3LBD蛋白多克隆抗体将为深入研究猪β3亚基在猪体内的表达分布及其在FMDV感染宿主细胞过程中的角色提供实验材料。
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