IFN

　　　　 作者：贺鹏程， 张梅， 李静， 曹云新， 蔡瑞波， 刘亚琳

【关键词】 IFN

　　[Abstract] AIM: To explore the possibility and the possible mechanism of reversing ATRAresistance in MR2 cells by using IFNα and IFNγ in combination with alltrans retinoic acid (ATRA). METHODS: After MR2 cells(ATRAresistance cell line) were treated with IFNα， IFNγ and ATRA alone or IFNα and IFNγ in combination with ATRA respectively， the cell proliferation was tested by MTT colorimetry， the cell differentiation was tested through light microscope， by NBT test and flow cytometry (FCM). The expression of promyelocytic leukemia (PML) protein was observed by indirect immunofluorescence staining. RESULTS: Both IFNα and IFNγ could inhibit the proliferation of MR2 cells. The effects were more obviously in both IFNα+ATRA group and IFNγ+ATRA group. But there were no significant difference between either IFNα group and IFNγ group or IFNα+ATRA group and IFNγ+ATRA group(P&>0.05). Both IFN could also induce the differentiation of MR2 cells. The effects of IFNα+ATRA group and IFNγ+ATRA group were more obvious. However， the differentiation of MR2 cells induced by IFNγ+ATRA group was more higher than that by IFNα+ATRA group(P&<0.05). Both IFN could induce the expression of PML protein. CONCLUSION: The reversing effcet of IFNγ+ATRA group on ATRAresistence in MR2 cells are more powerful than that of IFNα+ATRA group， which may be related to the different signal transduction pathway of IFNα and IFNγ.

　　[Keywords]IFNα; IFNγ; alltrans retinoic acid; ATRAresistance

　　[摘 要] 目的: 探讨IFNα和IFNγ与全反式维甲酸（alltrans retinoic acid， ATRA）联合逆转MR2细胞对ATRA耐药的可能性及其机制。方法: IFNα、 IFNγ及ATRA单独或两种IFN分别与ATRA联合作用于对ATRA耐药的细胞株MR2后， 采用MTT比色法检测细胞的增殖， 用光镜观察、 NBT还原实验及流式细胞仪检测细胞的分化， 用间接免疫荧光法检测早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia， PML)蛋白的表达。结果: 两种IFN均能抑制MR2细胞的增殖; IFN与ATRA联合应用时抑制作用更加显著; 但两种IFN无论是单独应用还是与ATRA联合应用， 二者之间均无统计学意义（P&>0.05）。两种IFN也能诱导MR2细胞发生一定程度的分化; 二者分别与ATRA联合应用时作用更加显著， 但IFNγ+ATRA组诱导MR2细胞分化的作用明显强于IFNα+ATRA组（P&<0.05）。两种IFN都能诱导PML蛋白的表达。结论: IFNγ与ATRA联合应用逆转MR2细胞对ATRA耐药的作用强于IFNα与ATRA的联合， 可能与IFNα和IFNγ信号传导途径的不同有关。

　　[关键词]IFNα; IFNγ; 全反式维甲酸; 维甲酸耐药

　　自我国学者首创应用全反式维甲酸（alltrans retinoic acid， ATRA）诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）获得重大成功以来[1]， 通过诱导分化治疗恶性肿瘤引起了国内外学者的广泛关注。但临床发现， 有相当一部分APL患者接受ATRA治疗后很快产生耐药性， 表现为缓解期缩短， 复发时再使用ATRA往往无效。因此， APL的复发与难治仍是目前临床上面临的一大难题。如何治疗对ATRA耐药的APL已经成为研究的热点之一。干扰素（IFN）是一种重要的细胞因子， 不仅能够抑制肿瘤细胞的生长， 而且已证实有逆转化疗药物耐药的作用。已有研究报道， APL对ATRA治疗的不敏感与缺乏IFN合成的某些蛋白质有一定的关系[2， 3]。为此， 我们探讨了将IFNα和IFNγ分别与ATRA联合， 逆转MR2细胞ATRA耐药的效果。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 MR2细胞株由上海瑞金医院血液研究所惠赠。全反式维甲酸（ATRA）购自Sigma公司（用无水乙醇配制成1×10-3 mol/L的储存液， 过滤、 分装， 于-20℃避光保存）。IFNα购自先灵葆雅有限公司（为干粉剂， 3×106 U/瓶， 用注射用水稀释成4×108 U/L， 于-20℃冷冻保存）。IFNγ购自上海克隆生物高技术有限公司（用注射用水稀释成4×108 U/L， 于-20℃保存）。兔抗人PML抗体购于Chemicon公司。羊抗兔FITCIgG购于KPL公司。抗CD11b和抗CD33单克隆抗体（mAb）均购于Immunotech公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及实验分组 将MR2细胞以1×109/L的密度接种于RPMI1640培养液中， 于37℃、 50 mL/LCO2饱和湿度条件下培养， 取处于对数生长期的细胞进行实验。实验分为6组， 即ATRA组、 IFNα组、 IFNγ组、 IFNα+ATRA组、 IFNγ+ATRA组及对照组。ATRA组加终浓度为1×10-6 mol/L的ATRA; IFNα组和IFNγ组分别加终浓度为1×106 U/L的IFNα和IFNγ; IFNα+ATRA组和IFNγ+ATRA组所加的IFNα、 IFNγ和ATRA的终浓度同前述; 对照组加RPMI1640培养液。

　　1.2.2 单独和联合用药对MR2细胞增殖的影响 将MR2细胞以5×107/L的密度接种于96孔培养板中， 100 μL/孔。实验分为实验组和对照组， 实验组中分别加入ATRA、 IFNα、 IFNγ、 IFNα+ATRA及IFNγ+ATRA， 100 μL/孔。ATRA的终浓度为1×10-6 mol/L， IFNα和IFNγ的终浓度均为1×106 U/L; 对照组加入100 μL的RPMI1640培养液， 各组均设3个复孔。分别于第1、 3、 5、 8天后， 用MTT比色法[4]检测MR2细胞的增殖。

　　1.2.3 单独和联合用药对MR2细胞分化的影响 将MR2细胞以5×107/L的密度接种于25 mL培养瓶中。实验分组及药物处理同1.2.1。①细胞的形态学观察: 3 d后收集细胞， 离心去上清， 取细胞沉淀涂片， 风干， 用GemisaWright’s（GW）染色后， 在光镜下观察细胞核的大小、 细胞质量的多少、 核浆比例以及核仁的变化。②NBT阳性细胞率的检测: 3 d后收集细胞， 离心去上清， 进行硝基四唑氮蓝（NBT）还原实验[5]。即加1 g/L的硝基四唑氮蓝（NBT）反应液0.5 mL（含1 g/L的NBT和100 μg/L的佛波酯）， 于37℃培养1 h。离心去上清， 取细胞沉淀涂片， 风干， GW染色后， 于油镜下观察， 并计数200个细胞， 计算NBT阳性细胞率。重复3遍取其平均值。NBT阳性细胞率=[(NBT阳性细胞数/细胞总数)]×100%。③CD11b和CD33表达的FCM分析: 3 d后收集细胞， 离心去上清， 取100 μL细胞悬液（细胞密度为5×105个左右）， 加入10 μL FITC抗CD11b或FITC抗CD33 mAb， 充分混匀， 于室温下（25℃）避光染色15~30 min。用PBS洗2遍， 离心去上清， 最后加入终浓度为20 g/L的多聚甲醛500 μL固定， 用FCM分析细胞表面分化抗原CD11b和CD33的表达。

　　1.2.4 早幼粒细胞白血病（PML）蛋白表达的检测 MR2细胞的培养、 实验分组及药物处理同1.2.1。3 d后收集细胞， 离心去上清， 用PBS稀释MR2细胞， 并调整细胞的密度为1×109/L。取0.1 mL制滴片， 立即进行间接免疫荧光检测。即将细胞用40 g/L多聚甲醛固定20 min后， 加1 mL/LTritonX100作用10 min。先用PBS浸泡漂洗2次， 每次5 min， 再用BSAPBS浸泡漂洗2次， 每次5 min。然后加1∶200免抗人抗PML抗体， 于37℃水浴1 h， 分别用BSAPBS和PBS各浸泡漂洗2次， 每次5 min。再加入1∶10 FITC羊抗免IgG， 于37℃水浴1 h， 分别用BSAPBS和PBS各浸泡漂洗2次， 每次5 min。加缓冲甘油后， 以盖玻片封片， 在荧光显微镜（激发波长488 nm）下观察结果并拍照。

　　2 结果

　　2.1 单独和联合用药对MR2细胞增殖的影响 除ATRA组外， 其余各实验组对MR2细胞的增殖均具有抑制作用。联合用药组对MR2细胞增殖的抑制作用明显高于单独用药组。各实验组对MR2细胞增殖的抑制作用依次为: IFN+ATRA组&>IFN组&>ATRA组（P&<0.05）。IFNα+ATRA组与IFNγ+ATRA组和IFNα组与IFNγ组之间相比较无统计学意义（P&>0.05， 图1）。

　　图1 单独和联合用药对MR2细胞增殖的影响（略）

　　Fig 1 Effects of independent and combined applying drugs on proliferation of MR2 cells

　　2.2 单独和联合用药对MR2细胞分化的影响

　　2.2.1 细胞形态学观察 单用IFNα、 IFNγ或ATRA作用3 d后， 以及IFNα+ATRA联合作用3 d后， MR2细胞形态学上均无分化的改变; 而将IFNγ与ATRA联合应用时， 部分MR2细胞出现了分化改变， 表现为可见细胞核缩小， 胞质量增多， 二者比例缩小， 核仁消失等。

　　2.2.2 NBT阳性细胞率的检测 NBT还原试验是从功能及生物化学变化方面来反映早幼粒细胞分化的常用指标。该实验的结果表明， 各实验组的MR2细胞中， NBT阳性细胞的比率均高于对照组。NBT阳性细胞比率的高低依次为: IFNγ+ATRA组&>IFNα+ATRA组≈IFNγ组&>IFNα组&>ATRA组（P&<0.05）。IFNα+ATRA组与IFNγ组之间相比较无统计学意义（P&>0.05， 图2）。

　　图2 各实验组NBT阳性细胞的比较（略）

　　Fig 2 The comparison of NBTpositive cells in various experiment groups（×1000）

　　A: Untreated MR2 cells (control); B: MR2 cells treated with ATRA alone; C: MR2 cells treated with IFNα alone; D: MR2 cells treated with IFNγ alone; E: MR2 cells treated with IFNα+ATRA; F: MR2 cells treated with IFNγ+ATRA.

　　2.2.3 CD11b和CD33表达的检测 CD11b常表达在较成熟的髓系细胞及白血病细胞表面， 而CD33常表达在非成熟细胞的表面。FCM分析表明， 各实验组MR2细胞上CD11b的表达率均高于对照组; 而CD33的表达率均低于对照组。各实验组诱导MR2细胞上CD11b表达的强度依次为: IFNγ+ATRA组&>IFNα+ATRA组≈IFNγ组&>IFNα组≈ATRA组; CD33表达的强度依次为: IFNγ+ATRA组

　　2.3 单独和联合用药对MR2细胞中PML蛋白表达的影响 免疫荧光染色检测表明， 对照组MR2细胞核内可见散在的、 细小的荧光颗粒（称为“满天星”状结构）。经ATRA处理后， MR2细胞核内荧光颗粒的分布未见明显变化。经IFNα和IFNγ处理后， MR2细胞核内的荧光颗粒较对照组略显粗大， 且数目增加， 但未出现粗大融合的荧光颗粒（即核体结构）。经IFNα+ATRA及IFNγ+ATRA联合作用后， MR2细胞核内仍然未见核体结构出现。由于IFNα和IFNγ对MR2细胞核内PML蛋白表达的影响基本相同， 故只显示IFNγ处理后的免疫荧光照片（图4）。

　　图3 不同药物作用后MR2细胞上CD11b和CD33表达的FCM分析（略）

　　Fig 3 The analysis of CD11b and CD33 expression on MR2 cells after treated with different drugs by FCM

　　AF: Expression of CD11b; af: Expression of CD33. A， a: Untreated MR2 cells (control); B， b: MR2 cells treated with ATRA alone; C， c: MR2 cells treated with IFNα alone; D， d: MR2 cells treated with IFNγ alone; E， e: MR2 cells treated with IFNα+ATRA; F， f: MR2 cells treated with IFNγ+ATRA.

　　图4 IFNγ、 ATRA和IFNγ+ATRA对MR2细胞中PML蛋白表达的影响（略）

　　Fig 4 Effects of IFNγ， ATRA and IFNγ+ATRA on PML protein in MR2 cells

　　A: Untreated MR2 cells (control); B: MR2 cells treated with ATRA alone; C: MR2 cells treated with IFNγ alone; D: MR2 cells treated with IFNγ+ATRA.

　　3 讨论

　　IFN具有抑制白血病细胞增殖的作用。ATRA作为一种细胞诱导分化剂， 同时具有抗增殖的作用[6]。应用MTT比色法检测证实， IFNα和IFNγ分别与ATRA联合都能够增强ATRA对MR2细胞增殖的抑制作用。免疫荧光染色检测显示， 两种IFN作用后， MR2细胞核内的荧光颗粒均比对照组粗大， 荧光颗粒数目增加， 说明PML蛋白的表达增多。有研究报道[7]， I型和II型干扰素均能促进PML蛋白的表达。PML基因启动子中含有IFNα/β刺激反应元件(ISRE)GAGAATCGAAACT和IFNγ激活位点(GAS)TTTACCGTAAG。IFN能与PML基因启动子中的ISRE或GAS结合而促进PML基因的转录和表达。PML蛋白为一种抑肿瘤因子， 能够抑制多种肿瘤细胞的生长。而在APL细胞内，由于出现了染色体t（15， 17）易位， 形成了早幼粒细胞白血病维甲酸受体α(PMLRARα)融合基因，并表达PMLRARα融合蛋白， 后者通过与PML蛋白形成异源二聚体而“扣押”(sequestration)PML蛋白; 同时染色体t（15， 17）的易位导致的1个PML等位基因的缺失， 造成了PML单倍体效率不足(haploinsufficiency)[8]。因此， 我们推测， IFNα和IFNγ对MR2细胞增殖的抑制作用可能是通过促进PML蛋白的表达而发挥作用的。我们应用NBT还原实验和FCM检测MR2细胞上CD11b和CD33的表达。结果表明， 两种IFN分别与ATRA联合应用， 均可促进ATRA诱导MR2细胞分化的作用， 但以IFNγ与ATRA联合应用时作用最强。形态学观察也发现， 单用ATRA、 IFNα和IFNγ以及IFNα+ATRA分别处理MR2细胞时， 均未出现细胞分化的现象; 而将IFNγ与ATRA联合应用时， 部分MR2细胞出现了细胞核凹陷、 核仁消失等细胞分化的现象， 说明IFNγ与ATRA联合能诱导MR2细胞发生一定程度的分化， 与Nason等[9]报道的IFNγ对耐ATRA的NB4R1细胞具有诱导其分化的作用相一致。IFNγ+ATRA逆转MR2细胞ATRA耐药的作用， 强于IFNα+ATRA， 其机制目前尚不清楚。研究发现， IFN和ATRA在调节许多细胞系的增殖和分化方面具有协同作用[10， 11]。这可能与ATRA和IFN在诱导某些基因（如RIGG、 RIGE和ISG）表达时具有协同作用密切相关。两种IFN都能够通过JAKSTAT途径在转录水平上调节IFN刺激基因(ISG)的表达， 从而参与细胞生长、 分化的调节。而ISG基因家族也能被ATRA所诱导。这可能和两种IFN分别与ATRA联合， 都能促进ATRA诱导MR2细胞分化的作用有关。维甲酸诱导基因G和E (RIGG， RIGE)均参与了ATRA诱导APL细胞分化和增殖的抑制作用， 而RIGG和RIGE基因的表达又受ATRA和IFNγ的共同调节[12]。IFN调节因子1 (IRF1)是ATRA的1个主要靶基因， ATRA和IFNγ都能通过与GAS结合而有效地刺激IRF1基因的表达[13]。而IRF1又可与ISRE结合， 从而促进ISG基因的表达， 参与细胞生长和分化的调节。以上结果可能就是IFNγ联合ATRA诱导MR2细胞分化的作用强于IFNα联合ATRA的重要原因之一。总之， 本研究的结果为临床上对ATRA耐药APL的治疗提供了一定的实验依据， 具有光明的前景。

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