作者：赵红斌 周焕发，曹敏丽，马慧，高明
【摘要】 探讨不同周期性应变对骨髓间充质干细胞(mesenchymal cells， MSCs)细胞形态变化的影响。1%、3%、10%、15% 拉伸应变(频率均为0.5 Hz)分别作用D1 细胞(间充质干细胞系) 12 h; 10 μg/ml 细胞松弛素B(Cytochalasin B ，CB)作用细胞1 h后， 设相同的条件进行平行实验;CB作用细胞1 h后， 10%应变作用细胞12 h和24 h，无CB细胞为对照，以上实验以非应变细胞做为对照。FITC-鬼笔环肽(FITC-Phalloidin )标记细胞微丝，碘化丙啶(propidium iodide ， PI)标记细胞核，激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构。1%、3%、10%、15%应变作用细胞后，细胞排列同受力方向分别呈平行、垂直、45°和平行排列;细胞微丝破坏后，细胞排列方式同非CB组相比有明显差异，细胞微丝结构发生断裂、重排。说明不同周期性应变能引起细胞形态结构改变，细胞形态的变化是细胞对应变反应的响应。
【关键词】 干细胞;周期性应变;激光共聚焦显微镜;细胞形态; 细胞骨架;分化
Abstract：To study the effects of different strain on morphologic change of mesenchymal stem cells (MSCs).The D1 cell line were cultured in vitro and then exposed to 1 % ， 3 % ， 10 % ， and 15 % strained respectively for 12 h . Cells were treated with Cytochalasin B(CB) for 1 h， the same experiment was undertaken. The other experiments were to treat cells with Cytochalasin B(CB) for 1 h， and expose to 10% strained for 12 and 24 h， unstrained cells as control，frequency was 0.5 Hz in all experiments. Cellular microfilament were marked with FITC-Phalloidin， Propidium Iodide (PI) marked nucleus.Application of technology of Confocal Lasar Scanning Microscopy( CLSM ) to observe cellular Morphologic change.Cellular arrangement were parallel， perpendicularity， 45°and parallel in corresponding with forced direction in 1%， 3%， 10%， 15% strain. After cellular microfilament were damaged by CB， cellular arrangement were obviously different to compared with strained. Cells were affected with 10% strain for 12 h and 24 h，cellular microfilament were rearranged and interrupted. The different strain can affect morphologic change of cells，it is different effect of cells exposed by strain.
Key words：Mesenchymal stem cells(MSCs);Confacal lasar scanning microscopy;Strain;Cellular morphology;Cytoskeleton;Differentiation
1 引 言
研究报道力学因素在干细胞定向分化过程中发挥着重要的作用，力学信号通过不同的信号途径将其信号转化为生物学信号，影响干细胞的定向分化进程[1]。迄今为止，对力学因素影响干细胞定向分化的机制尚不完全清楚。细胞形态结构的变化是细胞对力学刺激的重要外在表现，细胞受到不同应变时，细胞对力刺激的反应和表现形式不同，其原因尚不清楚[2]。研究力学因素对干细胞形态结构变化的影响，是了解力学因素影响干细胞定向分化分子机制的基本要求。
本实验利用力学生物学方法研究不同等轴应变对干细胞形态结构变化、细胞骨架微丝排列方式的影响，旨在为进一步阐明力学因素对干细胞定向分化影响的机制提供理论依据。
2 材料与方法
2.1 细胞
D1细胞购自美国ATCC公司。
2.2 试剂
高糖Dulbecco′s Modified Essential Medium (DMEM，Gibco公司)培养基， 胎牛血清(天津联星公司)， 细胞松弛素B，FITC鬼笔环肽(FITCPhalloidin )，碘化丙啶(propidium iodide， PI)，牛血清白蛋白(bovine albumin serum，BAS) 均为Sigma公司产品。
2.3 实验仪器
自行研制的基底膜拉伸试验仪;ACAS/Ultima 312型激光共聚焦显微镜(Meridian Instruments，USA)。
2.4 力学加载装置
该装置由控制系统和机械系统组成(见图1)，控制系统采用单片机控制步进电机，数码管实时显示运动状态，单片机控制电机实现控制拉伸应变大小、应变频率等功能。机械系统主要由步进电机、行程螺杆等组成，行程螺杆在步进电机的驱动下能够正转和反转实现对细胞力学载荷。采用无毒硅橡胶膜负载细胞，聚四氟乙稀制作培养池[3]。
2.5 细胞培养
D1细胞培养于含10 %胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置5% 37℃二氧化碳孵箱中培养。每周更换2次培养液，0.25 %的胰酶消化传代培养。
2.6 实验分组
(1)根据应变的大小分为5组，Ⅰ组(静态培养)、Ⅱ组(1%应变)、Ⅲ组(3%应变)、Ⅳ组(10%应变)、Ⅴ组(15%应变)作用时间均为12 h;加入含10 μg/ml CB的培养液作用1 h后，进行相同条件的平行实验。
(2)根据应变作用时间的长短，实验分3组， Ⅰ组(静态培养)、Ⅱ组(12 h)、Ⅲ组(24 h)，拉伸应变10 %;同时加入含10 μg/ml CB的培养液作用1 h后进行相同条件的平行实验。以上实验拉伸频率均为0.5 Hz 。
2.7 力加载实验
D1细胞培养于完全培养液中，置5% 37℃二氧化碳孵箱中。2次/周更换培养液。待D1细胞生长至融合状态，0.25%的胰酶消化传代培养。将1×104细胞接种到表面预先用鼠尾胶原包被硅橡胶膜上，其中间放置面积为4.56 cm2的金属环 (限制细胞的生长范围)，待D1细胞生长至融合状态时弃金属环，进行相应拉伸应变实验。
2.8 样本制备
实验完闭弃培养液， PBS(PH 7.4)洗2遍，4%多聚甲醛4℃固定过夜，PBS轻洗2遍，0.2% Triton X-100室温下渗透10 min， PBS轻洗2遍， 2 μg/mlRNA酶37℃作用30 min， PBS轻洗2遍， 1% BAS室温作用20 min(不洗)，5 μg/ml(PBS稀释) FITC-鬼笔环肽室温染色35 min，PBS清洗2遍后加入5 μg/ml的PI，室温染色30 min，甘油封片，上机观察。上述过程均需避光操作。
2.9 CLSM检测
利用激光共聚焦显微镜技术获取细胞清晰三维图象。
3 结果
3.1 不同应变对干细胞形态结构的影响
细胞受到机械力作用时，细胞形态结构发生明显改变。随着应变大小的变化，细胞的排列方式也随之发生相应改变，具体表现为：细胞由静态时的无规则、多角形转变为长梭形，依次同受力方向分别呈平行(1%)、90°(3%)和45°(10%)排列，15%的拉伸应变作用细胞后，细胞相互融合缺乏方向性。破坏细胞微丝结构后，细胞的排列方向同非CB组有相同的排列趋势，但细胞形态短而粗，两者存在明显差异(见图2)。
3.2 10%应变作用干细胞不同时间对细胞微丝排
列的影响 静态时细胞微丝排列清晰，随着应变拉伸时间延长，细胞微丝发生重排、聚集，主要分布在胞膜，细胞核多呈梭形。细胞微丝结构破坏后，细胞多为双核结构，随着应变拉伸时间的延长，微丝呈弥散分布(12 h)，点状或长梭状聚集于胞膜周围(24 h)，见图3。
4 讨 论
力学因素几乎影响体内所有的细胞，可改变其生物学行为，影响细胞的表型、基因的表达、代谢以及生长因子的自分泌和旁分泌[4]。当细胞受到机械力作用时，细胞对力作用产生若干响应，主要表现为局部效应和整体效应[5]。机械力对细胞排列方式的影响是细胞感应力学信号的外在表现形式，有研究报道细胞受到机械力作用后，细胞排列方向发生明显的变化，但结果并不完全相同。Dartsch等[6]实验证明，当细胞受到力作用时，细胞排列方向同应变的的方向一致;James等[7]用10%的应变作用上皮细胞30 min后，发现细胞的排列方向同应变方向约呈700，其原因尚不清楚。
本研究结果表明：不同应变作用细胞时，细胞形态和排列方式不同。小应变(1%)作用细胞后，细胞的排列方式同受力的方向基本一致;3%应变细胞同受力方向呈90°排列;10% 的拉伸应变使细胞同受力方向呈45°排列。大应变(15%)细胞排列同受力方向基本一致。究其原因细胞在该状态下受两种力的作用，一是应变拉伸的牵张力，二是细胞内分子蛋白相互作用形成的内力，两种力共同作用达到一定平衡后使细胞的形态和排列方式发生相应改变。我们的研究结果同文献报道有所不同，可能有以下几方面：一是由于不同的细胞对应变的感应不同所致，我们的实验细胞为骨髓间充质干细胞，而他们使用的是内皮细胞和上皮细胞;二是细胞接种的密度不同，细胞的重排方向也不同，高密度的细胞除受应变的影响外，同时还受临近细胞的相互影响，两者的共同作用使细胞排列的方向必定不同，三是细胞对一定强度的应变有耐受性，高密度融合细胞一般比低密度亚融合的细胞对应变的耐受性要高。
微丝是细胞重要的骨架结构，与细胞的运动、细胞形态和跨膜信息传递等功能密切相关。我们的研究发现破坏细胞微丝结构后，细胞的排列方向发生明显改变，同时细胞微丝发生重排和聚积，究其原因一方面是由于细胞微丝结构破坏后，细胞对力学刺激的感应能力显著降低，因为大量的研究表明对机械力起响应的结构主要是微丝;另一方面是因为细胞部分骨架功能的丧失使细胞自身产生的分子力减弱有密切关系[8]。细胞骨架微丝结构的完整性是决定细胞感应力学因素的重要条件之一，细胞微丝结构的重排是引起细胞结构变化的必然结果。当细胞受到外力作用时，细胞为了维持其正常的形态和功能，适应新环境，微丝结构发生改变是细胞自身采取的一种有效保护机制[9]。
尽管机械力促进干细胞定向分化的机理还不是完全清楚，但是细胞对机械力的若干响应是促进干细胞定向分化的基础。Altman等[10]认为机械力影响干细胞定向分化可能通过以下因素：(1)机械力能改变细胞营养、代谢及氧化水平;(2)激活细胞表面的牵张受体;(3)激活细胞膜受体或不同的离子通道引起信号级联反应。力学因素影响细胞形态结构的变化是促进干细胞定向分化的基本条件，细胞形态变化是细胞对力学刺激反应的表现形式，一方面随着应变的变化，细胞为了维持其形态结构通过细胞分子间的力对抗外力，其形态同受力方向产生一定的角度;另一方面细胞形态结构的这种变化也是细胞感知、响应力学信号的外在表现形式之一，细胞通过这种方式的变化能使细胞膜的离子通道开放，特别是Ca2+通道的开放，细胞膜上离子通道的开放激活相应的信号通路，促进干细胞定向分化[11]。细胞骨架微丝随着细胞形态的变化发生重排能影响整合素—细胞骨架信号途径，该信号通路的激活能将力学信号转化为生物学信号，影响干细胞的分化进程。细胞骨架的应力纤维是感应力学刺激的重要组织结构，细胞形态的变化能直接影响应力纤维从而使细胞感知力学信号，对干细胞的定向分化产生调节作用。
总之，应变作用于干细胞对其形态结构产生影响，不仅是细胞自身的保护性反应，同时也是细胞感应力学信号的必然结果，细胞通过这种形态结构的变化将力学信号转化为生物学信号，影响干细胞的定向分化。
参考文献
[1]Ward DF Jr， Williams WA， Schapiro NE， et al. Focal adhesion kinase signaling controls cyclic tensile strain enhanced collagen I-induced osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J]. Mol Cell Biomech，2007 ，4(4):177-88.
[2]Jennifer S P， Julia S F， Catherine Cheng，et al. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells[J]. Biotechnology and Bioengineering， 2004， 88(3):360-368.
[3]吴金辉，席桂清，张西正，等. 一种细胞基底拉伸加载装置的设计[J]. 军事医学科学院院刊，2005，29(4)：359-362.
[4]Grossi A， Yadav K， Lawson MA. Mechanical stimulation increases proliferation， differentiation and protein expression in culture: stimulation effects are substrate dependent[J].J Biomech，2007，40(15):3354-62.
[5]杜春鹃， 郭碧云，曾钧，等.细胞受体外机械力作用的若干反响[J].医学生物力学，2005，20(2):118-122.
[6]Dartsch P C， Betz E. Response of cultured endothelial cells to mechanical stimulation[J]. Basic Research in Cardiology，1989， 84:268-281.
[7]James H C， Pascal G C， Jeremiah Wille， et al. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching[J]. Journal of Biomechanics， 2001， 34:1563-1572.
[8]赵红斌， 张西正， 吴金辉，等. 不同应变对骨髓间充质干细胞系细胞骨架影响的研究[J].激光生物学报，2007，16(1);12-17.
[9]Doyle AM， Nerem RM， Ahsan T. Human mesenchymal stem cells form multicellular structures in response to applied cyclic strain[J]. Ann Biomed Eng，2009， 37(4):783-93.
[10]Altman GH， Horan RL， Martin I， et al. Cell differentiation by mechanical stress[J].FASEB J，2002，16(2):270-272.
[11]赵红斌，吕同德，马敬，等.机械力对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的力学响应机制研究[J].生物物理与生物化学进展， 2007，34(7):718-723.