【摘要】 采用计算机模拟的方法， 排除膜片钳实验观察中除钠通道以外的其它离子通道对实验结果的干扰，从野木瓜注射液对背根神经节细胞钠离子通道电流和动作电位影响的角度，研究野木瓜注射液的镇痛机制。用Hodgkin - Huxley模型拟合全细胞膜片钳实验所得的10％，25％和50％野木瓜注射液作用前后的膜片钳钠离子通道电流数据，进行参数估计，评价拟合优度，并将所获参数用于建立模拟神经元，在只改变模型钠离子通道参数的情况下，计算机仿真野木瓜注射液作用前后的背根神经节细胞动作电位。膜片钳实验结果表明，野木瓜注射液浓度依赖地抑制背根神经节细胞钠通道电流峰值，并影响通道的激活和失活过程。计算机模拟结果表明，野木瓜注射液作用后，钠通道半激活电压向去极化方向偏移，神经元产生动作电位的刺激电流阈值提高。说明野木瓜注射液可能通过影响钠离子通道激活过程从而阻滞初级感觉神经元动作电位，干预痛觉信息的传导，从而产生镇痛效果。
【关键词】 Hodgkin-Huxley模型；野木瓜注射液；全细胞膜片钳；背根神经节
Abstract：Using computer simulation to exclude other ion channels′s effect on patch clamp experiment results，the effect of injection stauntoniae on sodium channel currents and action potential in dorsal root ganglion neurons were observed to illuminate its analgesic mechanism. Hodgkin-Huxley model was used to fit the experimental data of whole cell patch clamp experiment which were recorded in dorsal root ganglion neurons in the absence and presence of 10%， 25% and 50 % injection stauntoniae. Model parameters were estimated and fitting quality was calculated. Based on the parameters， neuron models were built. When parameters of the sodium channel were changed， the action potentials in dorsal root ganglion neurons in the absence and presence of 10%， 25% and 50 % injection stauntoniae were generated by computer simulation.Patch clamp experimental results showed that injection stauntoniae inhibited the peak sodium currents in dorsal root ganglion neurons in a dose-dependent way and the activation and inactivation of the channels were influenced either. The results of computer simulation showed that the presence of injection stauntoniae shifted the half activation voltage of sodium channel to depolarization and the threshold activating action potential in dorsal root ganglion neuron increased.It proves that the analgesic effect of injection stauntoniae may be related to its interference with the transmission of nociceptive information in primary sensory neurons， which is caused by its inhibition on action potential in dorsal root ganglion neuron.
Key words：Hodgkin-Huxley model; Injection stauntoniae; Whole cell patch clamp; Dorsal root ganglion
1 引 言
野木瓜系木通科属植物，在临床上有显著的镇痛作用［1］。除了用于治疗坐骨神经痛、三叉神经痛等以外， 近来又被用于胆囊切除术、人工流产术、鼻咽癌放射增敏等治疗和研究［2］。虽然这些文献记录和临床实验观察表明野木瓜注射液(injection stauntoniae， IS)镇痛效果显著，但其镇痛的药理机制仍不十分明确。我们研究小组发现，野木瓜注射液能浓度依赖地抑制大鼠背根神经节（dorasl root ganglion， DRG）细胞钠通道电流峰值，并影响通道的激活和失活过程［3］。为了定量描述野木瓜注射液对DRG细胞钠离子通道电流以及动作电位产生的影响，本研究用Hodgkin-Huxley模型拟合野木瓜注射液作用前后DRG细胞钠通道电流数据，以得到野木瓜注射液作用前后定量描述钠离子通道特征模型参数的变化情况，进一步阐明野木瓜注射液对DRG细胞信息传导的干预作用。
初级感觉神经元产生动作电位是痛觉信息传入中枢的机制，DRG细胞钠离子电流是引起细胞膜去极化的初始化电流，是动作电位产生的前提条件［4］。但是，目前的全细胞膜片钳实验技术观察DRG细胞动作电位时，由于不能应用工具药阻断某些离子通道，因而不能排除野木瓜注射液通过作用于除钠通道外的其他种类离子通道进而影响动作电位［5］的可能。为了排除这种可能性，本研究先根据DRG细胞的大小、膜电容等一般特征和上文提及的钠离子通道模型参数，建立一个DRG神经元模型，再进行钳制电流的计算机仿真刺激，如此排除药物对其他离子通道的影响，确定野木瓜注射液对DRG细胞动作电位的影响及机制。
2 材料和方法
2.1 膜片钳实验数据
本研究所采用的膜片钳实验数据来自我们研究小组对野木瓜注射液作用于DRG细胞钠通道电流影响的膜片钳实验［3］。在急性分离的大鼠背根神经节细胞膜上，进行全细胞膜片钳记录，观察到浓度为10％，25％和50％的野木瓜注射液对电压门控性钠离子通道电流的影响。上述实验得到的数据均用Igor Pro软件导出为软件Neurofit（Hodgkin-Huxley模型的拟合软件）使用的纯文本文件，见图1、表1。表1 Igor软件导出的纯文本膜片钳实验数据举例注：表1中Time列和其他各列单元格数据组成的点与图1中曲线上的点对应。
2.2 计算机拟合钠通道电流膜片钳实验数据的模型—Hodgkin-Huxley模型
Hodgkin-Huxley模型［6］为解释神经细胞动作电位产生提供了一个数量模型。模型建立的理论基础是通过神经元细胞膜的总电流等于膜电容电流和各种离子电流的和：
Im=Cmdvdt+Iion(1)
根据膜片钳实验经验，Hodgkin-Huxley模型用通过细胞膜的钾、钠离子电流和漏电流代替Iion：
Im=Cmdvdt+IK+INa+IL(2)
Iion=gNa(Vm-ENa)+gk(Vm-VK)+gL(Vm-EL)(3)
其中gx=gx∏ipi。gx是一个标准常数，表示当所有通道开放时的电导。pi表示通道中亚单位i的开放概率，在这里用m，n，h来表示：
Iion=gNam3h(Vm-ENa)+gkn4(Vm-VK)+gL(Vm-EL)(4)
m，h分别表示钠离子通道的激活门和失活门控的开放概率，驱动钠离子通道的开放和关闭。n驱动钾离子通道开放，m，n，h是电压依赖的概率值，统一用p表示，在电压V一定的情况下，均满足：
dpdt=α(V)(1-p)+β(V)p(5)
α(V)是描述电压门从关闭到开放的电压依赖速率常数，β(V)是描述电压门从开放到关闭的电压依赖速率常数。（4）式等价于（5）式：
dpdt=p∞-pτp(6)
τp=1αp+βp(7)
p∞=αpαp+βp(8)
p∞描述p的最大值，也就是在一定电压条件下通道平衡时刻的值。τp描述p增大到p∞的时间常数。
上述Hodgkin-Huxley模型中，INa=gNam3h(Vm-ENa)，将膜片钳实验得到的实验数据：10%，25%，50%野木瓜注射液影响下的钠离子通道电流，采用Neurofit软件分析拟合，得到模型参数钠电导最大值gmax(ks)，半激活电压V2m(mv)，半失活电压V2h(mv)。各组数据采用单因素方差分析。
2.3 计算机仿真DRG细胞动作电位
首先，根据DRG细胞膜电生理特性和解剖特征［7］，将DRG神经元细胞设定为一个表面积为2 800 μm2，膜电容24 pf，细胞质电阻为35.4 Ωm的球形。并将Hodgkin-Huxley模型中有关钾电流和漏电流的部分按照经验值做如下设置［8］：gkmax设置为0.465 s/cm2，gmax设置为0.0003 s/cm2，ENa设置为50 mv，Ek设置为-77 mv，El设置为-54.3 mv，静息电位设置为-65 mv。细胞关于钠电流的参数设置为Hodgkin-Huxley模型拟合实验数据得到的平均值。参照上述参数设置，在使用Neuron仿真环境建立DRG细胞模型后，进行计算机仿真刺激，静息电位设置为-65 mV，钳制电流幅值从0以0.1 pA递增，直至动作电位产生。每次记录时间50 ms，刺激持续时间20 ms，延时10 ms。
3 结果
3.1 不同浓度野木瓜注射液对Hodgkin-Huxley模型参数的影响
Hodgkin-Huxley m3h钠通道模型能够很好地拟合正常钠离子通道电流［8］，也能很好地拟合不同浓度野木瓜注射液作用后的DRG细胞钠通道电流。拟合效果的评价参照Neurofit软件提供的评价标准：拟合值和原始值的差与噪声比的平方和小于20。以下拟合参数的原始数据均来源于全细胞膜片钳实验镜下直径相近的DRG细胞钠电流数据，保证了膜电容等细胞物理性质相近，拟合得到的Hodgkin - Huxley模型参数有可比性。拟合效果达到Neurofit软件的要求。为了判断根据野木瓜注射液浓度分组得到的不同gmax、V2m、V2h参数分组的差异确实是由于不同浓度野木瓜注射液作用导致，对上述3组数据分别用SPSS 13.0做单因素方差分析。结果表明：不同浓度野木瓜作用后，DRG细胞钠离子电流Hodgkin-Huxley模型的gmax、V2h参数没有显著差异。参数V2m有显著差异。表2给出了每组数据的平均值和方差具体数据。表2 不同浓度野木瓜注射液作用后钠电流的拟合参数
3.2 计算机仿真刺激DRG细胞模型结果
当刺激电流为0.8pA时，野木瓜注射液作用前的DRG细胞能够产生峰值约为38 mV动作电位，但不能刺激10%，25%，和50%野木瓜注射液作用后的DRG细胞产生动作电位。10%，25%，和50%野木瓜注射液作用后的DRG细胞产生动作电位的阈刺激强度分别为1.0 pA，1.1 pA和1.3 pA，阈电流刺激产生的DRG细胞动作电位峰值分别为35 mV、30 mV和15 mV。结果见图2。
4 讨论
在以往对野木瓜注射液影响DRG细胞钠离子
图2 (a)膜片钳实验记录到的DRG细胞动作电位；
(b) 野木瓜注射液作用前的DRG细胞能够产生动作电位；
(c) 10%野木瓜注射液作用后的DRG细胞不能产生动作电位
Fig 2 (a)DRG cell action potential recorded by patch clamp;(b)DRG cell can generate action potential in the presence of injection stauntoniae;(c)DRG cell can not generate action potential in the presence of 10% injection atauntoniae
通道电流的研究［3］中，更加注重药物浓度对通道电流峰值的影响，对描述电压门控离子通道动力学特征的半失活电压和半激活电压的讨论也仅仅是从电压电导曲线粗略估计半失活电压和半激活电压的参数值。这样得到的参数值仅考虑了条件电压和通道电流的关系，与Hodgkin-Huxley模型拟合得到的参数值并不完全相符。而Hodgkin-Huxley模型能更加准确和定量描述离子通道的动力学特征。
对拟合参数的方差分析显示，野木瓜注射液作用后的DRG细胞钠离子通道动力学特征有所改变，具体表现是半激活电压向去极化方向偏移，而钠电导和半失活电压则没有变化。从神经元动作电位产生的角度来说，半激活电压描述了细胞兴奋性。而DRG细胞钠离子通道正是DRG神经元兴奋性产生的基础［4］。DRG神经元作为初级感觉神经元，其兴奋性增加，动作电位产生频率加大，可以导致痛觉过敏和慢性疼痛［9］。因此，野木瓜注射液的镇痛作用可能来自于对DRG神经元动作电位产生的抑制。膜片钳实验证实了野木瓜注射液对DRG细胞钠通道电流有峰值抑制作用，也证实了野木瓜注射液使DRG神经元半激活电压向去极化方向偏移。这两者都会抑制DRG神经元产生动作电位。但是，因为不能排除野木瓜注射液对其他离子通道有影响，现有的膜片钳实验条件并不能说明野木瓜注射液对DRG细胞动作电位产生的抑制作用来自于它对钠离子通道的影响。
在计算机模拟仿真刺激DRG细胞的实验中，模拟的DRG细胞都有相同的特征。唯一不同的就是Hodgkin-Huxley模型钠离子相关参数设置为野木瓜注射液作用后的不同Neurofit软件拟合参数。这样的仿真排除了野木瓜注射液的其他药理作用，其对DRG细胞动作电位产生的影响完全来自于对DRG细胞钠离子通道的作用。这表明，野木瓜注射液对DRG细胞钠离子通道的影响，能够抑制DRG细胞动作电位的产生。进而说明，野木瓜注射液通过影响DRG细胞钠离子通道电流，抑制其动作电位产生是野木瓜注射液镇痛的机制之一。
野木瓜是一种临床广泛使用的常用中药。在中药药理研究中，即使是单味药，其有效成份的确定和药理作用的定量研究一直是一个难题。本研究从数学模型和计算机模拟的角度，排除了许多不确定因素，简化了实验条件。给出了野木瓜注射液影响DRG细胞半激活电压的具体数值。这样的研究方法和角度也许对中药现代化研究有所帮助。
参考文献
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