【摘要】 探讨氩氦刀冻融兔肝后局部结缔组织的变化过程，为临床上氩氦刀治疗肝脏肿瘤提供实验依据。将氩氦刀置于兔肝表面进行2个冻融循环，在不同时间点取局部肝组织，经HE和胶原染色后在光镜下观察。冻融后1、2 d，冻融区与未冻融区之间无结缔组织产生。冻融后第4 d，在近肝门的交界线的冻融区侧有纤细的结缔组织增生。第8 d近肝门侧的交界处的结缔组织增生带增宽，其余交界处亦形成较薄的结缔组织带。第16 d近肝门侧及周围的组织带进一步增宽。第30 d，周围的结缔组织带与表面的结缔组织带贴近或合并，形成一个盘状疤痕覆盖在新生的肝组织表面。说明氩氦刀冻融后冻融区内的结缔组织经历一个急速变性，缓慢变质并被逐渐吸收的过程。而冻融区周围则产生结缔组织并逐渐增厚形成结缔组织带，逐渐地底层的结缔组织带与表面的结缔组织带靠近进而相贴，形成一个圆盘状的疤痕贴在新生的肝组织表面。
【关键词】 氩氦刀;兔;动物实验;组织形态学;结缔组织
Abstract：To explore the histomorphologic changes of the interstitial connective tissue(ICT) of rabbit liver frozen by Cryocare and provide an experimental basis for clinical treatment of hepatic tumor cryosurgery.The hepatic tissues frozen and thawed for two circulation were taken down respectively at different time points and observed on light microscope. Results showed that the ICT in frozen area was lightly degenerative and there was no connective tissue at the boundary line at the first and second d after freezing . The ICT in frozen area was degenerative and decreased gradually from the fourth to the sixteenth d and disappeared at the thirtieth d.A proliferative layer of fiberblast and some fine collegen bunches was appeared at the boundary line at the fourth d， and the band became wider gradually form at the eighth to sixteenth d， and finaly the bottom band merged with the surface layer and formed a plate-like scar tissue covering the surface of the local liver.The ICT in frozen area undergoes a chronic process from degenerative to gradual dissolution and that around the frozen area experiences however a course from appearance， increase to cicatricial tissue.
Key words：CryocareTM; Rabbit; Animal experiment; Hepatic tissue ; Connective tissue; Histomorphology
1 引 言
氩氦靶向治疗技术已成为临床治疗实体肿瘤的重要手段，临床应用证明该技术对许多肿瘤都有效[1]。治疗后会出现有别于一般炎症的反应和修复过程，且在不同组织器官其病理变化和修复过程亦不同。研究氩氦刀靶向治疗后不同时间冷冻灶及其周围组织的病理变化特点将有助于该技术的合理应用。本研究观察了氩氦刀冻融兔肝后不同时间冻融区内及其周围结缔组织的变化，旨在探讨冻融后肝组织的修复过程，为临床上氩氦刀治疗肝脏肿瘤提供实验依据。
2 材料与方法
2.1 氩氦刀
美国恩多凯尔(endocare)公司产品，四刀系统。
2.2 动物
大耳白兔50只，雌雄不限，体重2.5～3 kg，实验分正常对照组，冻融5、10 min组。实施冻融后，分别在1、2、4、8、16、30 d处死动物。
2.3 氩氦刀实施过程
经耳静脉注射氯胺酮5 ml麻醉动物，剪去胸腹部毛，活性碘局部皮肤消毒，于剑突下至脐部切开腹部，暴露肝脏，以直径2 mm的氩氦刀垂直于肝表面，轻压约2～3 mm深，不刺破肝脏，先行氩气冷冻5、10 min，后行氦气热融3 min，重复一次。缝合切口、消毒包扎后正常饲养动物。
2.4 组织处理与观察
在近肝门侧取含冷冻区和正常区的肝组织一块3 mm厚，以10%甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，分别进行苏木素-伊红(H-E)染色及胶原染色(VG)，在光镜下观察冻融区内及其周围的结缔组织变化。
3 结果
3.1 冷冻区内结缔组织的变化
冷冻后第1、2 d，冷冻区内中央区肝窦内皮、中央静脉内皮消失，其周围的胶原收缩、移位呈断续的不规则的点状，着色性较正常区的弱。汇管区的血管内皮、小胆管上皮脱落溶解消失，其周围的胶原部分萎缩，局部断裂，走向紊乱。大的血管内皮脱落，大的胆管上皮部分脱落及溶解消失，其周围的胶原萎缩。在中央区外周的核碎片区及出血区内[2]，中央静脉内皮脱落，汇管区内血管的内皮脱落，小胆管上皮部分脱落。大的汇管区中的血管内皮和胆管上皮未脱落，该区域中的胶原未见明显改变。在交界线上可见未冷冻的汇管区呈半岛状凸入冷冻区，其中的血管内皮、胆管上皮存在，其周围的胶原未见明显改变。冻融后第4、8 d，中央静脉周胶原明显萎缩，走向紊乱并明显减少;汇管区的血管内皮消失，胆管上皮呈残余状堆积于腔中，其周围的胶原萎缩、断裂。较大汇管区的血管内皮脱落并已溶解消失，胆管上皮脱落堆积于损伤的腔内，其周围的胶原明显断裂，散乱，有明显的溶解水化区(见图1)。第16 d，中央静脉周胶原接近消失。汇管区内血管、胆管的形态结构消失。仅存在明显萎缩、紊乱、大部分已溶解消失的胶原残余。较大汇管区的血管壁、胆管壁处的胶原萎缩、断裂，大部分已消失。第30 d，冻融区内的结缔组织胶原完全消失，仅剩下含多泡状巨噬细胞岛的液化区。
3.2 冻融区与未冻融区之间结缔组织的变化
冻融后第1、2 d，冻融后与未冻融区之间无结缔组织产生。冻融后第4 d，在近肝门侧交界线的冻融区侧有约0.01～0.05 mm宽的由数条至数十条纤细胶原束及少量成纤维细胞组成的结缔组织带。第8 d时，近肝门侧冻融区与未冻融区之间的交界带宽约0.5 mm(见图2)，在远离肝门的冻融区的周围的结缔组织带宽为0.1 mm，此期结缔组织带已完全包围冻融区。第16 d，近肝门侧的交界带宽达2～4 mm，周围的结缔组织带宽达0.2～0.5 mm。在第8、16 d组中，在近肝门侧的交界带的外侧与正常肝组织相邻面较整齐，细胞成分少，胶原成分多(见图2);而交界带的内侧多不整齐，胶原成分少，胶原密度小，细胞成分多，多见成纤维细胞、毛细血管内皮及胶原向冻融区浸润，穿行于死亡的肝细胞残体之间(见图3)。在远离肝门侧的冻融区的周围，结缔组织带平行贴于坏死的肝组织表面，未见带内侧向坏死区生长的构象。第30 d时冻融区的肝组织已消失，其底层的结缔组织带与表面的带接近相贴，形成一个圆盘状疤痕覆盖于新生的肝组织表面(见图4)。
4 讨论
4.1 氩氦刀冻融后冻融区内结缔组织的变化
从观察结果看，氩氦刀冻融后冻融区内原有的结缔组织包括肝窦周、中央静脉周、各级汇管区中的结缔组织不再增生，而是经历一个逐渐变性，缓慢被溶解吸收的过程。其中，肝窦周、中央静脉周的结缔组织先消失，汇管区及较大汇管区的结缔组织在16 d之后逐渐消失。30 d时冻融区内原有的结缔组织全部消失。本研究证明：同肝实质一样，冻融区内的结缔组织经历一个逐渐变性、坏死并被溶解吸收的过程[3]，但与肝实质相比，在缺血缺氧的条件下结缔组织有更强的耐受性。
4.2 冻融区周围结缔组织的变化
本研究证明：在近肝门侧的冻融区与未冻融区之间的交界线的冻融区侧最先有成纤维细胞增生，有胶原产生，并且该处结缔组织增生的速度亦最快，交界带最宽，胶原密度最大。而在远离肝门的交界线处胶原产生较迟，增生速度亦慢，结缔组织层较薄，胶原密度亦轻、稀疏。这进一步证明交界线上的结缔组织增生的时间、增生速度、程度都与局部血液供应有关[4]。在近肝门侧，冻融后仍有充足的血液供应，有足够的代谢底物，所以该处修复反应出现的最早、速度亦最快，是结缔组织增生反应最活跃的区域。而在远离肝门的交界线上冻融后很可能破坏了局部的血液供应[5]，阻断了营养物质的运送，要待局部血液供应恢复后，才能发生修复性反应，因而这些部位结缔组织出现的晚、速度亦慢，是增生反应相对不活跃的部位。
我们观察结缔组织最先发生于近肝门侧交界线的冻融区侧，随着时间延长，成纤维细胞及其分泌的胶原不断增多，一方面不断充实已形成的结缔组织带，另一方面则继续长入冻融区。因此，结缔组织带的外侧较整齐，而内侧面多不整齐，增生的成纤维细胞、毛细血管内皮细胞及胶原纤维会伸向冻融区，占居冻融区的肝实质、间质坏死液化形成的空隙，并逐渐取代原来的血管、胆管及胶原。交界线上结缔组织的增生是损伤区修复的一个方面，其意义在于包围冻融后坏死的肝组织，使清除坏死肝组织残体的过程局限在结缔组织包围的范围内，限制坏死有害物质的扩散。然而，交界线上结缔组织增生是有限的。修复过程的主要方面是随着冻融区内肝组织残余的溶解、吸收，原冻融区逐渐变小，其交界带外围肝组织会逐渐增生，趋向恢复原来的肝叶形状，这使深部的结缔组织层向表层靠近并相贴，形成一个圆盘状疤痕覆盖于新生的肝组织表面。该疤痕的消失可能是一个相当缓慢的过程[3]，甚至在肝脏结构与功能恢复后相当长的时间里存在。
参考文献
[1]Zhang Jiren. A new challenge on clinical oncology : argon-helium targeted ablation therapy [J] . International Journal of morden cancer therapy ， 2002， 5(1): 20-23.
[2]李德忠，宋华志，易峰涛，等. 氩氦刀冷冻兔肝后局部组织变化及超微病理研究[J]. 华南国防医学杂志，2006， 20(3): 4-6.
[3]张积仁. Cryocare 氩氦靶向肿瘤治疗技术[J]. 生物医学工程研究，2005，24(2)：128-132.
[4]罗保明，刘建平，文艳玲，等. 肝门部冷冻对肝脏血流动力学影响的实验研究[J].中国超声医学杂志，1999， 15(1): 11-13.
[5]Larson TR， Probertson DW， Corica A， et al.In vivo interstitial temperature mapping of the human prostate during Cryosurgery with correlation to histopathologic outcome [J]. Urology， 2000， 55(4): 547-552.