作者：朱昌来，李峰，尤庆生，陆松华，王庆庆，林琳，张天一
【摘要】 制备细菌纤维素，观察纳米细菌纤维素的超微结构特点。用红茶菌做菌种，通过茶水发酵培养制备纳米细菌纤维素，利用扫描电镜、透射电镜观察其超微结构特点。结果表明：新鲜制备的细菌纤维素膜为无色透明胶冻状膜，表面光滑；经预处理后呈乳白色半透明胶冻状；扫描电镜下可见细菌纤维素膜呈疏松的网状结构，纤维素微纤丝从菌体胞壁小孔中分泌出来；透射电镜下，经负染后，在深色的背景中间可见浅色细丝状。说明细菌纤维素具有良好的纳米纤维网络特征，在生物医学领域具有良好的、广泛的应用前景。
【关键词】 纳米材料；细菌纤维素；超微结构；组织工程；电子显微镜
Abstract：To prepare the biomaterial bacterial cellulose (BC) and observe the characteristic of its ultra-structure. Red-tea fungus was used as the culturing strain， and nanometer biomaterial BC produced through fermentation of tea， then the ultra-structure of nanometer biomaterial BC was observed by SEM and TEM. Results showed that BC membranes that fresh prepared was smooth、colorless and jel alike and it showed translucence after pre-disposal treatment. The surface of BC membranes was porous network structure observed by SEM， and the micro-fibrils of BC were secreted from the eyelet of cell wall. Tint fine thread could be found in dark background after negative staining observed by TEM.It proves that BC has fine nano fibre-network， which has extensive usage in biomedicine areas.
Key words：Nanometer material；Bacterial cellulose；Ultra-structure；Tissue engineering；Eletron microscope
1 引 言
细菌纤维素 (bacterial cellulose，BC)是由微生物（主要为细菌）发酵形成的一类纤维素，是葡萄糖以β-1，4-糖苷链连接形成的高分子化合物，它与植物纤维素化学组成非常相似，因其在吸水性、物理和机械性能等诸多方面的优良性能，在医药、生物医学工程、造纸和食品工业等领域中具有广泛的应用前景，是国际生物医用材料研究的热点之一。本研究用红茶菌做菌种，通过茶水发酵制备纳米细菌纤维素，同时通过对扫描和透射电镜下细菌纤维素的结构的观察，深入了解其纳米级的结构特点。
2 材料和方法
2.1 材料
红茶菌菌种 (购自黑龙江黑河)、葡萄糖（AR）、蔗糖（AR）、乙醇（食用级）、蛋白胨、市售绿茶。扫描电子显微镜（ S-3400N，Hitachi），透射电子显微镜（JEM-1230，JEOL）。
2.2 方法
2.2.1 基础发酵培养基的配制 按绿茶(干基):糖:水=0.5:100:1000，先将水煮沸，加入绿茶浸泡于85～90 ℃温度，保持20 min，滤去茶叶渣得到绿茶汁，按比例加入溶化的糖水（其中葡萄糖和蔗糖的比例为1：1），再加入0.5 %蛋白胨、1 %乙醇（V/V），混匀后分装到三角瓶中，每500 ml装入200 ml 糖茶水，用牛皮纸包扎，巴氏消毒后冷却到室温备用。
2.2.2 接种培养 红茶菌菌种放入消过毒的浅盘中，倒入适量基础发酵培养基，在30℃恒温条件下静止培养7天。
2.2.3 细菌纤维素的提取和处理 恒温静置培养7 d后，生成细菌纤维素膜浮于液面。膜取出后，用蒸馏水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，100 ℃煮沸20 min，去除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明。将以上制得的细菌纤维素膜置于装有生理盐水的烧杯中，以121 ℃ 高压消毒20 min备用。
2.2.4 纳米细菌纤维素超微结构观察 取纳米细菌纤维素膜1 cm2左右，干燥后直接于离子溅射仪上喷镀金属铂，然后在SEM下观察标本结构；将纳米细菌纤维素经超声粉碎后制成纤维素悬液，经4%磷钨酸负染后于TEM下观察。
3 结果与讨论
3.1 恒温静置培养7d后，生成细菌纤维素膜，经提取和预处理后呈乳白色半透明胶状液膜，外表均匀光滑，有一定的张力，见图1。
3.2 SEM下观察细菌纤维素膜的表面结构特征
在扫描电镜下可见菌体呈杆状，细菌纤维素膜表面菌体及从菌体胞壁小孔中分泌出来的纤维素微纤丝；细菌纤维素细丝为纳米级，大量的纳米纤维相互交织形成不规则疏松的网状结构。见图2、3。
3.3 经负染后在TEM下观察到的细菌纤维素结构
细菌纤维素膜经超声粉碎，负染后于透射电镜下可见在深色条状深染背景中有透明细丝状纤维丝，纤维丝仍交织成网状，见图4。
4 讨论
细菌合成纤维素是Brown 1886年首次报道的。他发现木醋杆菌（Acetobacter xylinum）在静止培养时，于培养基表面形成一层白色纤维状物质。经化学与物理方法分析，确定此类物质具有纤维素的结构与化学性质，因其属细菌合成而命名为细菌纤维素。有文献报道［1］产纤维素的细菌主要为木醋杆菌，细菌细胞壁侧有一列50～80个轴向排列小孔，在适宜条件下，每个细胞每秒钟可将1.5×108个葡萄糖分子以β-1， 4-糖苷键相连成聚葡糖，从小孔中分泌出来，形成直径1.78 nm左右的纤维素微纤 丝（cellulose microfibrils），并随分泌量的持续增加平行向前延伸。相邻的几根微纤丝之间通过氢键相互连接，形成直径３～４ nm的微纤束（Bundle）。微纤束进一步伸长，相互缠绕，多束合并形成一根长度不定、宽30～100 nm、厚3～8 nm的细菌纤维条（Ribbon），其直径和宽度仅为棉纤维的1/100～1/1000，是已知纤维中最细的。纤维条互相交织，形成不规则网状或絮状多孔结构，在液面形成凝胶状菌膜。除木醋杆菌外，能够产生BC的细菌主要还有Acetobacter，Rhizobium，Agrobacterium，和Sarcina等［2］。
用于发酵培养红茶菌的菌种主要是醋酸菌和酵母菌，有的红茶菌种中含有少量乳酸菌［主要是保加利亚乳杆菌(Lactobacterium bulagricum)］。酵母菌和醋酸菌在红茶菌中是相互依赖的共生关系，因为在发酵开始阶段，醋酸菌生长所需要的葡萄糖、果糖和乙醇由酵母菌将蔗糖降解生成；而醋酸菌产生的乙酸又会刺激酵母菌产生乙醇，而乙酸、乙醇的存在可保护醋酸菌和酵母菌，使其免受其它微生物的侵染［3］。成膜后，由于经过碱处理及清洗，膜上已不会有残留的酵母菌等成分。由于红茶菌中成分相对复杂，用其培养获得的细菌纤维素在其结构尤其是在机械性能上可以弥补从单一的木醋杆菌中获取纤维素存在的不足，故在组织工程研究中利用红茶菌来获取细菌纤维素可能更好；尤其在营养保健方面，红茶菌更具有其独特的科学利用价值。
本研究通过扫描电镜观察证实，细菌从菌体胞壁小孔中分泌纤维素微纤丝，细菌纤维素条相互交织形成的不规则疏松的网状结构，肉眼观下的膜状结构是由高密度微纤维相互缠绕形成。透射电镜下观察细菌纤维素的结构，鲜有文献报道，本研究将纤维素膜结构在超声粉碎经负染后，通过透射电镜下观察也表明，这些膜结构是由超微纤维组成的超微纤维网，同扫描电镜下所见的结构相同。
由于细菌纤维素具有优秀的生物相容性和良好的生物可降解性，其在生物医学领域有着广泛的应用。在人工血管方面，Henrik等研究了细菌纤维素作为潜在的组织工程血管支架的机械性能，并比较了细菌纤维素、猪动脉血管以及膨体聚四氟乙烯( ePTFE)支架在机械性能上的差异，结果表明细菌纤维的应变能力与动脉血管相似，这很可能是由于纳米纤维结构的相似性造成的［4］。而BC在人工皮肤的研究中也取得重要进展。Sanchavanakit等［5］利用人类角化细胞和成纤维细胞来评价BC膜的潜在生物作用机理，研究结果直接证明了BC 膜支持人类角化细胞的生长、增生和移动，但是对成纤维细胞没有作用。BC在组织工程支架中的应用上，Helenius等［6］从慢性炎症反应、异物排斥反应以及细胞向内生长和血管生成等方面的特征来评价植入物的体内相容性。结果发现植入物周围无肉眼和显微镜可见的炎症反应，没有纤维化被膜和巨细胞生成，未引起任何慢性炎症反应。因此，可以断定BC的生物相容性非常好，在组织工程支架构建方面具有潜在价值。
细菌纤维素的产量较低，制约了其应用，有研究表明通过搅拌或振荡培养有利于细菌菌体的生长，提高搅拌速度至一个合适的范围，可以显著提高纤维素产量［7］，本实验通过相应的改进措施，获得了较高的纳米细菌纤维素产率，为进一步研究提高了基础。
本研究以红茶菌为菌种，通过茶水发酵分离制备纳米细菌纤维素的方法同传统方法相比，操作简单，成本低廉，为将来细菌纤维素的大规模生产提供了一条新途径。
参考文献
［1］Ross P， Mayer R， Benziman Met al. Cellulose biosynthesis and function in bacteria ［J］. Microbiol Mol Biol Rev，1991， 55(1): 35-58.
［2］Jonas R， Farah L F. Production and application of microbial cellulose ［J］. Polymer Degradation and Stability， 1998， 59(1-3): 101-106.
［3］Liu C H，Hsu W H，Lee F L，et al. The isolation and identification of microbes from a fermented tea beverage， Haipao，and their interations during Haipao fermentation［J］. Food Microbiology， 1996， 13(6): 407-415.
［4］Henrik B， Gisela H， Aase B， et al. Mechanical properties of bacterial cellulose and interactions with smooth muscle cells ［J］. Biomaterials， 2006， 27 (9) : 2141-2149.
［5］Sanchavanakit N， Sangrungraungroj W， aomongkolgit R， et al. Growth of human keratinocytes and fibroblasts on bacterial cellulose film ［J］. Biotechnol Prog， 2006， 22 (4) : 1194-1199.
［6］Helenius G， Baeckdahl H， Bodin A， et al. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose ［J］. Journal of Biomedical Materials Research， 2006， 76 (2) : 431-438.
［7］JUNG JY，PARK JK， CHANG HN， Bacterial cellulose production by Gluconacetobacter hansenii in an agitated culture without living non-cellulose producing cells［J］.Enzyme and Microbial Technol， 2005，37（3）:337-347.