作者：吴沛桥，巴晓革，胡海，赵静
【摘要】 源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)，是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。我们就GFP的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。
【关键词】 绿色荧光蛋白（GFP）；标记物；荧光特性；进展；改进；应用
Abstract：The green fluorescent protein (GFP) from the jellyfish Aequorea vietoria is a great potential for application of the marker， has a wide range of applications. The article on the physical and chemical properties， the fluorescence characteristics， improvement and application of GFP are reviewed.
Key words：Green fluorescent protein; Marker;Fluorescence characteristics;Progress; Improvement; Application
1 引 言
发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962年Shimomura等［1］首先从多管水母(Aequoria victoria)中分离出一种分子量为20kD的称为Aequorin的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。随后，人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP，其中研究较为深入的是来自多管水母科(Aequorleidae)和海紫罗兰科(Renillidae)的GFP，即Aequoria GFP和Renilla GFP。
2 GFP的理化性质，荧光特性及其改进
2.1 GFP的理化性质
从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。Aequoria GFP分子量约27×103，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽；而Renilla GFP是分子量为54kD的同型二聚体。两种GFP有不同的激发光谱，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；Renilla GFP在498 nm具有强烈的光吸收，肩峰为470 nm。两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（λmax=508～509 nm）。
GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH＜4.0或pH＞12.0的条件下用6 mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在很大的pH范围内（pH7～12.2）的吸收、发射光谱也是相同的。Renilla GFP的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。根据Sheen等［2］的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。
2.2 GFP的荧光原理
GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。由65～67位的氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮（4-p-hydroxybene-5-imidazolinone），形成生色团（基于组成生色团的元件不同，可将已知的GFP及其变种分为7种，每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长）［3-5］。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450～490 nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10 min以上，不像其他荧光素，荧光容易淬灭。其中，GFP的一个引人注目的特点，其生色团的形成没有物种的特异性，可以在翻译后2～4 h通过自动催化作用来合成。Cubitt等［6］认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此Kolb等［7］提出一个假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。
2.3 GFP的荧光性质及应用优点［8-9］
GFP的荧光性质比较特殊，具有诸多优点而备受关注。
(1) 易于检测，灵敏度高。GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次，即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的，在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。
(2) 荧光性质稳定。GFP对光漂白（一种荧光衰减现象）有较强的耐受性，能耐受长时间的光照，从而延长了可探测时间；GFP在pH7～12范围内也能正常发光，对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。
(3) 对细胞无毒害。从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能没有影响，转化后细胞仍可连续传代。
(4) 构建载体方便。由于编码GFP的基因序列很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。
(5) 可直接用于活细胞测定。GFP是能在异源细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且GFP的分子量较小，N-端和C-端都能忍受蛋白的融合，是理想的标记物，可进行活细胞实时定位观察，更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态，还可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助荧光显微镜观察，使研究更为方便。使用激光共聚焦显微镜，其图像效果更佳，结合现代的计算机软件，可进行三维显示。
(6) 不受假阳性干扰。由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果，GFP作为分子探针可以代替荧光染料，避免由于染料扩散造成的定位不准，使结果真实可靠。
(7) 广谱性。表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达，其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。
(8) 易于得到突变体。如GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强了荧光强度，适合在不同物种中专性表达。
2.4 GFP的改进
尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点，但是野生型GFP（wtGFP）具有一定的缺点：如GFP有两个激发峰影响了其特异性，并且长波激发峰强度较小，不易观察；GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折叠受温度影响大，表达量较低；而且在某些植物细胞中并不表达。这些都限制了进一步的应用，所以，一些研究人员运用定点突变、DNA-shuffling等技术对GFP进行了改进，获得了荧光光谱、量子产率、溶解性、密码子嗜性、温度敏感性等改变的多种突变体，扩大了GFP的应用范围。
2.5 GFP的改进方法
2.5.1 除去GFP基因中隐蔽型内含子 Haseloff等［10］利用农杆菌把含花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的GFPcDNA转入到拟南芥上，但在转基因拟南芥幼苗上检测不到GFP的荧光。经研究发现这是由于GFP片段中第405～488碱基序列转录的mRNA被植物误识别为内含子，从而被错误加工，导致GFP不能正确表达。因此改变碱基组分，消除隐蔽型内含子，可以避免植物细胞的错误剪接。如突变型mGFP改变了碱基组分后，在转基因拟南芥中检测到荧光，但荧光强度较弱。
2.5.2 消除编码蛋白的积累 Haseloff等［10］认为消除隐蔽型内含子后的突变体mGFP荧光较弱，可能是由于编码蛋白的积聚。增加ER定位信号可部分消除编码蛋白的积累，增加荧光强度。
2.5.3 改变碱基组分 Zolotukhin等［11］改变了wtGFP基因编码区中88个密码子中的92个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替，使GFP的荧光强度提高22倍。其中S65T突变提高了GFP的荧光强度，Y66H突变使之同时具有部分蓝色荧光蛋白（BFP）的性能，但其蓝色荧光强度很低。这种GFPh是一种人工全合成的适合在哺乳动物细胞中高效表达GFP的突变体。McCullough等［12］对水母的密码子进行优化修饰，更换为植物偏爱密码子，即增加G和C的含量，降低A和T含量，改造的GFP基因表达效率可有较大提高。
2.5.4 更换GFP生色团氨基酸 Heim等［4］将wtGFP中的Ser65用Thr替代，得到突变体S65T-GFP，相比wtGFP具有明显的改进。首先，S65T-GFP激发谱中只有一个峰，且红移至490 nm，是一种红移荧光蛋白(RSFP)。用蓝光即可激发RSFP，更适于普通荧光显微镜观察。其次，激发后产生的荧光强度是wtGFP的6倍，并且对光漂白具有更强的抵抗性。最后，这种突变体分子的成熟速度比wtGFP快4倍，从而缩短了从合成到发光的时间。
2.5.5 插入植物内含子 许多真核启动子能在细菌细胞中表达，所以在转化早期检测荧光表达时，不能确定检测到的荧光是由农杆菌还是由植物发出的。但如果在GFP中插入带有几个终止子的内含子， 使突变体在细菌中不能表达， 而在植物中能正常表达。并且，Pang等［13］研究发现，在GFP或S65T-GFP基因的398和399位核苷酸之间插入一个植物内含子，如马铃薯基因ST-SL1的第二内含子（IV2），还可增加GFP的荧光强度。
2.5.6 增加增强子和更换强启动子 由于GFP作为标记物的最大缺陷是不能像酶一样具有信号放大作用，故灵敏度不高。所以，GFP在受体内的表达水平的提高有赖于寻找到更为通用的转录翻译的增强子和更换更强的启动子以驱动GFP基因的大量表达。目前已找到了一系列这种功能较强的质粒载体［14］，用这些载体转染的细胞，GFP基因的表达频率大大提高，荧光强度也高的多。
3 GFP的应用
GFP的应用主要集中在利用其荧光性质的基础上作为一种标记物。
3.1 GFP在分子生物学上的应用
3.1.1 GFP作为报告基因 报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的DNA，如传统的荧光素酶（LUX）基因和β-葡萄糖苷酶（GUS）基因。GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。目前，此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得到非常广泛的应用，特别是在活细胞基因表达的时空成像方面［15］。
3.1.2 GFP作为融合标签
GFP最成功的一类应用就是把GFP作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。在多数情况下，GFP基因在N-或C-末端与异源基因用常规的分子生物学手段就可以接合构成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。GFP的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以检测蛋白质分子的定位、迁移，还可以研究蛋白质分子的相互作用以及蛋白质构象变化，并依靠荧光共振能量转移即FRET来进行检测。
3.2 作为生物传感器
3.2.1 检测pH 野生型GFP和其许多突变体都具有依赖于pH的荧光变化，因而可以被用来检测活细胞内的pH。人们通常称它们为Phluprin。分为两类：比率Phluorin和盈缺Phluorin。当pH降低时，比率Phluorin的最大激发波长从395 nm到475 nm迁移，利用两个最大波长处的荧光强度的比率可以测量pH；当pH值小于6时，盈缺Phluorin在475nm处没有荧光。当pH回复到中性时，两类Phluorin都会在20 ms内复原。Hanson等［16］在2002年就设计了一系列GFP突变体deGFP，作为双波长比率测量的pH探针，用于细胞内检测。
3.2.2 检测卤素离子 YFP（H148Q）变体不但对pH敏感而且对不同离子也同样敏感，故可以用来检测亚细胞结构中卤素离子的浓度和传递［17］。
3.2.3 其他检测应用 另外，GFP可以应用于检测电位、氧化还原水平以及在信号转导中作为Ca2+指示剂［18］。
3.3 GFP在细胞生物学上的应用
GFP具有同宿主蛋白构成融合子的性质，利用这一性质，可以将GFP定位到特定的细胞器和膜系统中，进行细胞生理过程、细胞动力学等的实时观测，或直接应用于定量分析。目前，GFP已经被成功地用于靶向标记包括细胞核、线粒体、质体、内质网等在内的细胞器。用GFP进行亚细胞定位，避免了提纯蛋白、标记异硫氰酸荧光素等荧光染料、经显微注射或其他方式导入细胞的复杂方法，从而使研究蛋白在活细胞的准确定位变得简单易行。
3.4 GFP在筛选方面的应用
3.4.1 GFP用于细胞的筛选 基于GFP的荧光特性，并且荧光稳定以及检测方法快速、方便，GFP在细胞筛选上得到应用广泛。Yuk［19］等使用GFP作为标记能快速筛选出在生长抑制环境下，仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。
3.4.2 GFP用于药物的筛选 利用GFP对目的物进行标记，追踪GFP，分析目的物在细胞中的变化情况，如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化，从而筛选出与体内信号分子功能相似的化合物［20］。
4 问题与展望
GFP近几年得到了广泛的应用与发展，成为各研究领域的宠儿，但由于基础理论研究远不及应用研究，因而其存在着一些问题与不足，如检测的灵敏度还有待进一步提高；荧光强度的非线性性质使其定量非常困难；新生GFP通过折叠和加工成为具有活性的形式，过程十分缓慢；紫外激发对某些GFP有光漂白和光破坏作用；多数生物具有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，干扰某些GFP的检测等。
考虑到上述问题与不足，GFP如要在各领域得到更加完整全面的应用，至少还需要几个条件：基础理论体系的成熟完善、新型优良突变体的诞生以及与各种现代生物技术的融合。与此同时，随着基因工程技术和细胞工程技术的日益成熟，我们有理由相信， GFP一定会给我们带来更多的应用价值，并进一步揭开生命的未解之谜。
参考文献
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