作者：胡泉，李颖，周瑾，王常勇
【摘要】 我国是世界上急性肝衰竭和终末性肝病发病人数最多的国家。目前，这两种疾病治疗的唯一有效手段是进行肝移植。但肝脏供体紧缺制约了移植手术的发展。组织工程学是解决肝脏生物制造最有效的方法，但是肝组织工程的发展依然需要克服一系列技术挑战，包括种子细胞种类、来源；支架材料性能和结构的要求；组织、器官体外培养和构建等方面等难题。我们相信随着科学技术的不断发展，在不久的将来，通过组织工程方法必将成功构造一个具有各种生理功能的可移植的肝脏。
【关键词】 组织工程；肝衰竭；肝脏移植；支架材料；生物反应器；生物人工肝
Abstract：China is the country which hold the highest incidence rate of acute and chronic liver disease. Liver transplantation is the only effective way for the disease. However， its clinical development is hampered by the shortage of organ supply. Tissue engineering appeares the most promising therapy for liver diseases. However， there are many technical challenges including the cell source，nontoxic and biocompatible material in vitro cultivation of the construct.With the fast development of technology，a functional tissue engineered liver capable of transplantation will be constructed successfully in the near future.
Key words：Tissue engineering；Hepatic failure；Liver transplantation；Scaffold；Bioreactor；Biological artificial liver
1 引 言
肝脏是机体最重要的生命器官之一，具有复杂的结构和多种生理功能，急、慢性肝脏疾病，尤其是肝功能衰竭严重影响着人们的健康。肝脏移植是从根本上治疗慢性肝病与肝功能衰竭的方法［1］，但受到供体肝脏匮乏、异种移植失败和需要长期使用免疫抑制剂的限制［2］。因此，肝脏疾病治疗急需寻求新的方法，肝脏组织工程为肝病的治疗带来了新的希望。
组织工程学是20世纪80年代末发展起来的一门新兴交叉学科，近年来，随着生命科学、材料科学和工程科学的发展，科研人员相继在多种组织、器官体外再造的研究方面取得突破性进展，其中，一些组织工程产品如软骨、皮肤已实现商品化［3-4］。肝脏组织工程是组织工程研究领域中的重要研究方向之一，其目标是构建一个可供移植的肝脏组织或类器官，从而对肝功能受损的患者进行治疗。现今，科学家已模拟体内自然肝脏，成功构建出具有一定功能和活力的组织工程化人造肝脏系统。然而，由于肝脏组织结构和生理功能的复杂性，构建一个具有功能和可移植的组织工程化肝脏的工作仍面临极为严峻的挑战。
总结过去二十年组织工程研究的经验和教训，越来越多的研究人员意识到，组织工程研究应充分考虑各方面因素，拓宽现有的研究手段和思路［5］。近年来，随着各学科的创新与发展，肝脏组织工程研究取得了丰硕的成果，相信随着人们对肝脏体内外构建研究的深入，组织工程化肝脏构建研究有望取得实质性突破。
2 种子细胞种类、来源
在肝组织工程研究中，种子细胞的选择非常重要，已研究的有下列几种细胞，例如骨髓源干细胞，肝卵圆祖细胞，成熟肝细胞，肝细胞株［2，6-7］。选择哪一种细胞要根据需要以及期望这种细胞所展现出来的肝细胞特性而定。
2.1 骨髓源干细胞
骨髓源干细胞具有多向分化的特性，且来源于自体，可避免排斥反应，这些特性和优点使其成为最有潜力的种子细胞来源。但是我们对其定向诱导为肝细胞的机制并不完全了解［2，8-10］。关于诱导机制中生长因子，细胞信号在细胞外基质传导，特殊的细胞信号通路正在研究中。
2.2 肝卵圆祖细胞
肝卵圆祖细胞在肝脏中与临近的肝细胞和分化终末期的胆管形成细胞紧密相连，是一种过渡的胆管细胞。这种细胞不一定分化为成熟肝细胞，在分化为特定的细胞系之前具有多种分化选择［8-9］。例如：可以通过不同的细胞信号分化为肝脏中其他功能细胞。若能设法为卵圆细胞创造理想的条件，使之能朝我们需要的细胞系方向分化，其应用前景很乐观。
2.3 成熟肝细胞
成熟肝细胞可以通过完整或切除的部分肝脏灌注来获得，但细胞在体外培养后不完全具有和体内肝细胞相同的表型和功能，原因是体外培养环境不能完全模拟体内的生长环境，同时也缺少其它细胞类型信号的影响。许多研究者为提高体外培养的肝细胞活性和功能状态做了大量的工作，主要集中在两方面：一是利用肝细胞的细胞外基质成分和肝细胞的极性使肝细胞集落生长并增强集落内部的营养和氧气供应；二是将肝细胞和其它非肝实质细胞共培养。但由于是终末性细胞，很难传代培养，而且原代肝细胞多取之于鼠和猪之类的动物，不易直接用于体内。
2.4 肝细胞株
目前，肝细胞株主要是指肿瘤来源的细胞株。这些细胞株包括HepG2/C3A或SV40 Tag，能大量长期培养，增殖能力强，而且具有一定肝细胞的功能水平如白蛋白合成和细胞色素P450活性等，是目前最有希望应用于人工肝临床实验研究的一类细胞［2，7，10］。但是，这些细胞源于肿瘤，临床应用时，必须考虑有可能引发肿瘤发生的风险。
3 肝组织工程中的支架材料
支架材料是组织工程研究中的一部分，其作用在于为细胞的贴附提供空间支持，增加细胞粘附表面积，支持较大的细胞团块生长发育［11-12］。目前肝组织工程支架材料的研究还处于筛选阶段。主要是在现有结构性组织工程中表现较好的可降解高分子材料和天然基质材料中选用，如PLGA、海藻酸钠、壳聚糖、胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白、透明质酸等。
3.1肝组织工程生物材料的修饰与改性
纵观目前国内外医用生物材料的研究，不难发现适合肝组织工程支架的材料寥寥无几。天然高分子材料具有生物可降解性，良好的力学性能以及可调节的降解速度，然而，这些材料的细胞相容性不够理想。天然基质材料虽然生物相容性较好，但力学性能差，一般难以满足组织工程材料支架对力学强度的要求。如果能利用修饰或者改性的方法，使天然高分子材料和人工高分子聚合物扬长避短，则有可能制造出一类兼有良好的力学性能和细胞相容性的生物材料，更好的使细胞贴附，生长和行使功能。近年来，这一研究方向引起了人们极大的兴趣。特别是把一些特异的生物活性分子固定在框架材料上具有极其重要的意义。对框架进行这样的表面修饰之后，原理上可以引起植入细胞产生某些特殊的反应，而这些反应又是人们可预见和可控制的。这些修饰可为种植于其上的细胞提供了合适的环境因素，这些经过多因素修饰后并能活化细胞功能的多聚物被认为是生物活性材料。
3.2 植入材料体内组织相容性判断
材料植入动物体内后，为评价材料植入后与组织之间的相互作用，需要建立一套评价方法：比如用全自动生化分析仪动态监测植入后动物血清中肝功多项指标如解毒功能、分泌功能（白蛋白、胆红素）和相关酶类的变化情况；同时必须考虑体内的免疫反应。由于实验动物多使用同种异体细胞，而植入体是材料与细胞的复合物。因此，要同时考虑机体对异体细胞和生物材料的不同反应。组织工程肝脏植入体内后，需要检测体内是否发生免疫反应以及免疫反应的轻重，探索免疫反应发生的机理，为最终减轻甚至排除免疫反应提供支持。
4 组织和器官体外培养和构建
4.1 生物反应器
生物反应器是一个封闭系统，由接种肝细胞后的多聚材料形成包囊，管接循环介质，培养液贮存器，捕捉气泡的除泡器，以及可以氧化培养液的增氧器组成［13］。
研究证明形成包囊的多聚材料可以促进细胞贴附，并且其多孔性有利于细胞接触以及营养交换，能为细胞贴附生长提供更广阔的空间。培养液循环系统可以增加细胞团中心细胞摄入营养和氧气，帮助其排除代谢废物和二氧化碳，明显降低细胞团中心细胞的死亡率。
基于以上优点，肝细胞可以在生物反应器中长期存活，并保持细胞色素p-450和肝脏产物如白蛋白分泌的功能。更重要的是通过在生物反应器的培养，可以对组织工程肝脏未来应用所需的体内外特殊参数检测提供了前景［13-15］。
4.2 生物人工肝
生物人工肝(biological artificial liver ， BAL) 是将肝细胞培养在体外生物反应器中，当患者血液流过反应器时，通过半透膜或直接接触的方式与培养的肝细胞进行物质交换，使其中的肝细胞发挥解毒、合成、生物转化等功能，从而达到支持和治疗目的。
1963年Nose教授等在成功通过血液透析系统治疗肾功能衰竭50年后， 首次报道一种替代肝脏合成和代谢功能的装置， 这是生物人工肝早期雏型。1986年Demetrion教授提出生物人工肝的概念， 即由肝细胞和人工解毒装置共同组成的循环系统， 能发挥肝细胞的作用［16］。
此后，匹兹堡大学与Mc Gowan研究所设计了生物人工肝反应支持系统（BLSS），使患者血液可以通过生物人工肝的循环取得物质交换和毒素的弥散，但交换过程中纤维膜阻止患者的血液直接接触猪肝细胞，有效地防止了异种病毒感染，保护了患者的健康［17-19］。
BAL在临床实验方面证明，它可以临时代替自然肝脏的部分功能。但还有许多需要克服的困难，毕竟一个可植入性的功能性的肝脏对患者进行长期的功能支持才是我们所希望的最好的选择［20］。
5 结论与展望
肝组织工程是一个多学科交叉领域，它是生物学、材料科学、信息科学、制造科学和临床医学等一系列相关学科的发展和技术的创新与集成。现今，肝组织工程研究尚处于起步阶段，还存在许多问题，如选择异种肝细胞将面临免疫排斥和异种病毒感染；生物反应器中细胞培养的血管化；人工肝的功能表达要求各种功能细胞共培养和各类生长因子协调作用等问题亟待解决。但是，肝组织工程的研究成果已十分显著。随着肝组织工程取得每一个新的进展，我们就向获得可植入的人造肝脏前进了一步。虽然构建出可植入的完整肝脏现阶段还不现实，但我们相信不远的将来此研究成果必将造福人类。
参考文献
［1］Davis MW， Vacanti JP. Toward development of an implantable tissue-engineered liver［J］.Biomaterials，1996，17(3):365 -372.
［2］Allen JW， Bhatia SN. Engineering liver therapies for the future［J］.Tissue Eng，2002，8(5):725 -737.
［3］Willers C， Partsalis T， Zheng MH. Articular cartilage repair: procedures versus products ［J］.Expert Rev Med Devices， 2007， 4(3):373-92.
［4］Clark RA， Ghosh K， Tonnesen MG. Tissue engineering for cutaneous wounds ［J］. J Invest Dermatol， 2007， 127(5):1018-1029.
［5］Kaplan DL， Moon RT， Vunjak-Novakovic G. It takes a village to grow a tissue［J］. Nat Biotechnol， 2005， 23(10):1237-1239.
［6］Mitaka T， Mizuguchi T， Sato F，et al.Growth and maturation of small hepatocytes［J］. J Gastroenterol Hepatol，1998，13(Suppl.):S70-S77.
［7］Nyberg SL， Remmel RP， Mann HJ，et al.Primary hepatocytes outperform HepG2 cells as the source of biotransformation functions in a bioartificial liver［J］. Ann Surg，1994，220(1):59-67.
［8］Faris RA， Konkin T， Halpert G. Liver stem cells: a potentialsource of hepatocytes for the treatment of human liver disease［J］.Artif Organs，2001，25(7):513-521.
［9］Noishiki Y. Dreams for the future in the field of in vivo tissue engineering［J］. Artif Organs，2001，25(3):159-163.
［10］Gupta S， Malhi H， Gorla GR. Re-Engineering the liver with natural biomaterials［J］. Yonsei Med J，2000，41(6):814-824.
［11］Kahterine M，Kulig，Joseph P.Hepatic tissue engineering［J］.Transplant Immunology，2004，12:303-310.
［12］Terada S， Sato M， Sevy A，et al. Tissue engineering in the twenty-first century［J］. Yonsei Med J，2000，41(6):685-691.
［13］Kim SS， Sundback CA， Kaihara S， et al. Dynamic seeding andin vitro culture of hepatocytes in a flow perfusion system［J］.Tissue Eng，2000，6(1):39-44.
［14］Powers MJ， Janigian DM， Wack KE，et al. Functional behavior of primary rat liver cells in a three-dimensional perfused microarray bioreactor［J］. Tissue Eng，2002，8(3):499-512.
［15］Powers MJ， Domansky K， Kaazempur-Mofrad MR， et al. Amicrofabricated array bioreactor for perfused 3D liver culture［J］.Biotechnol Bioeng，2002，78(3):257 -269.
［16］Demetriou AA， Whiting J， Levenson SM，et al.New method of hepatocyte transplantation and extracorporeal liver support［J］.Ann Surg，1986，204: 259-271.
［17］Mazariegos GV， Kramer DJ， Lopez RC， et al. Safety observations in phase I clinical evaluation of the Excorp Medical Bioartificial Liver Support System after the first four patients［J］. ASAIO，2001，47:471-475.
［18］Mazariegos GV， Patzer JF II， Lopez RC， et al. First clinical use of a novel bioartificial liver support system (BLSS)［J］. Am J Transplant，2002，2(3):260-266.
［19］Patzer JF II， Mazariegos GV， Lopez R. Preclinical evaluation of the excorpmedical Inc，bioartificial liver support system［J］. J Am Coll Surg，2002，195(3):299-310.
［20］Kuddus R， Patzer JF II， Lopez R， et al. Clinical and laboratory evaluation of the safety of a bioartificial liver assist device for potential transmission of porcine endogenous retrovirus［J］. Transplantation，2002，73(3):740-749.