天然茯苓和液体发酵茯苓质量标准的研究

　　　　　　 作者：李羿， 万德光， 钟世红， 李晨

【摘要】 液体发酵茯苓为采用现代发酵工程技术生产的一种新型发酵中药。2005年版中国药典茯苓的质量标准尚不完善。笔者在粉末显微特征、三萜类化合物、多糖、灰分和氨基酸含量等方面，对液体发酵茯苓和天然茯苓展开研究，建立其质量标准，为其质量控制打下基础。

【关键词】 天然茯苓; 液体发酵茯苓; 质量标准

　　【Abstract】 The liquid fermented Poria cocos is a new type of fermented traditional Chinese medicine produced by modern fermentation technology.The standard of Poria cocos is not perfect in Chinese Pharmacopeia(2005).We studied the microscopic characteristics，terpenoids，polysaccharides，ash and amino acids content of natural Poria cocos and liquid fermented Poria cocos.Thus，the standards of natural Poria cocos and liquid fermented Poria cocos were established，which provided a basis for its quality control.

　　【Key words】 natural Poria cocos;liquid fermented Poria cocos;quality standard

　　茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf的干燥菌核，为利水渗湿要药[1]。茯苓可通过野生采集、人工栽培和发酵培养三个途径获得。除野生采集获得天然茯苓外，可采用传统的茯苓栽培法(固体发酵)来生产天然茯苓[2]，或采用现代发酵工程技术来生产液体发酵茯苓[3]。天然茯苓和液体发酵茯苓由于发酵培养基和发酵方式不同，导致天然茯苓和液体发酵茯苓(发酵中药茯苓)的代谢途径和代谢产物有所差异。因此，液体发酵茯苓为一种新型发酵中药[46]。2005年版中国药典仅在检查项目中对茯苓水分、总灰分和酸不溶性灰分有定量要求，而对茯苓主要活性成分多糖、三萜类化合物都未有明确要求[7]，对液体发酵茯苓质量标准的制定工作尚未开展，缺乏完善的天然茯苓和液体发酵茯苓质量标准，严重地影响了茯苓质量的有效控制和资源的开发利用。因此，笔者在对天然茯苓和液体发酵茯苓研究的基础上，制定了天然茯苓和液体发酵茯苓的质量标准，为茯苓相关保健食品和药品的开发打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　天然茯苓为购于成都杏林大药房的茯苓丁。液体发酵茯苓为经发酵罐补料液体发酵5 d的发酵液离心干燥后所得[8]。

　　酵母浸膏、蛋白胨为Oxoid产品;苯酚(须重蒸);薄层层析硅胶GF254(青岛海洋化工有限公司);葡萄糖、K2HPO4、MgSO4.7h3O、盐酸、氯仿、丁醇、乙醇、丙酮、乙醚和NaOH等试剂均采用国产分析纯。

　　全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);NBS Bioflo Ⅲ 型发酵罐;Beckman J2HS 型离心机;Sartorius BP121S 型电子天平;Leica DM 1000 型显微镜;Lambda 35 UV/VIS Spectrometer紫外分光光度仪;ZF90型暗箱式紫外透射仪(上海顾村电光仪器厂);氨基酸自动分析仪;灰分测定装置;FW 177 型粉碎机。

　　1.2 茯苓粉末的制备

　　将烘干的液体发酵茯苓和天然茯苓分别放入粉碎器中粉碎，过筛(筛子孔径为0.17～0.25 μm)，烘箱中60 ℃烘干至恒重，装入有塞瓶中，贴上标签，放入干燥器内备用。

　　1.3 茯苓粉末的显微鉴定

　　1.3.1 茯苓粉末的临时水装片 洗净擦干载玻片及盖玻片。用玻璃吸管加1滴蒸馏水于载玻片中央，用镊子取少许制备的液体发酵茯苓和天然茯苓粉末于蒸馏水中，用解剖针搅匀，再盖上盖玻片，注意不要产生气泡，多余液体用小滤纸条吸干。

　　1.3.2 茯苓粉末的临时水合氯醛装片 洗净擦干载玻片及盖玻片。用玻璃吸管加1滴水合氯醛溶液于载玻片中央，用镊子取少许制备的液体发酵茯苓和天然茯苓粉末于液滴中，用解剖针搅匀，接着手持载玻片的一端于酒精灯上均匀加热(注意加热时不要使液体沸腾，以免产生大量的气泡)，然后离开酒精灯，加1滴稀甘油充分混匀，如此加热3～5次。加盖玻片，并将多余的封藏液用小滤纸条吸干。

　　1.3.3 茯苓粉末的显微观察 观察菌丝团块采用水装片;观察菌丝采用水合氯醛透化装片。将制备好的液体发酵茯苓或天然茯苓样品分别置于显微镜下，先用低倍镜观察，再换用高倍镜观察。

　　1.4 茯苓粉末三萜类化合物的薄层层析

　　1.4.1 样品溶液的制备 用天平称取天然茯苓和液体发酵茯苓粉末各2 g，加入40 ml乙醚，4 ℃冷浸提取48 h，过滤，挥发干滤液，即得棕黄色含多种茯苓三萜化合物的混合物。用0.5 ml乙醚分别溶解茯苓三萜成分的混合物，得到茯苓三萜类化合物的样品液。

　　1.4.2 薄层条件 固定相:硅胶GF254CMCNa板;流动相:环己烷氯仿丙酮(7.5︰3 ︰1)。

　　1.4.3 展开与检识 天然茯苓和液体发酵茯苓粉末的三萜成分混合物的样品液点样后，上行展开约10 cm，取出，挥发干溶剂，在紫外灯254 nm和365 nm下检识。

　　1.5 茯苓粉末总糖的测定

　　用苯酚硫酸法测定糖含量[9]，以葡萄糖化学对照品为对照标准品。

　　1.6 茯苓粉末水溶性多糖和碱溶性多糖的测定

　　用电子天平分别精确称取天然茯苓粉末和液体发酵茯苓粉末各20 g，按天然茯苓粉末和液体发酵茯苓粉末中多糖的提取工艺进行茯苓多糖的提取分离[10]，用电子天平分别精确称量天然茯苓粉末或液体发酵茯苓粉末水溶性和碱溶性茯苓多糖纯品，计算其水溶性和碱溶性茯苓多糖的提取率。

　　1.7 茯苓粉末灰分的测定

　　1.7.1 茯苓粉末总灰分的测定 天然茯苓粉末和液体发酵茯苓粉末总灰分的测定按中华人民共和国国家标准GB/T 83062002.

　　1.7.2 茯苓粉末水溶性灰分的测定 天然茯苓粉末和液体发酵茯苓粉末水溶性灰分的测定按中华人民共和国国家标准GB/T 83072002.

　　1.7.3 茯苓粉末酸不溶性灰分的测定 天然茯苓粉末和液体发酵茯苓粉末酸不溶性灰分的测定按中华人民共和国国家标准GB/T 83082002.

　　1.8 茯苓粉末氨基酸的测定

　　天然茯苓粉末和液体发酵茯苓粉末氨基酸的测定按中华人民共和国国家标准GB/T 5009.124200.

　　2 结果

　　2.1 茯苓粉末的显微鉴定

　　2.1.1 天然茯苓的显微鉴定 天然茯苓粉末白色或灰白色，无色团块散在，呈不规则颗粒状或末端钝圆的分枝状。粉末遇水合氯醛液粘化成胶冻状，加热团块物渐溶化，显露菌丝。菌丝多为无色，细长，直径2～8 μm，单枝或分枝(见图1)。

　　2.1.2 液体发酵茯苓的显微鉴定 发酵中药茯苓粉末棕黄色。棕黄色团块散在，可见无色团块。粉末遇水合氯醛液加热团块物渐溶化，显露菌丝。菌丝无色或淡黄色，细长，直径4～17 μm，稍弯曲，多单枝(见图2)。

　　天然茯苓粉末和液体发酵茯苓粉末的显微特征很相似。发酵茯苓粉末菌丝分枝较多，且菌丝较粗壮;而天然茯苓粉末分枝较少，且菌丝较细长。

　　2.2 茯苓粉末三萜类化合物的薄层层析

　　以天然茯苓作为对照，在环己烷︰氯仿︰丙酮(7.5︰3︰1)的流动相下，在紫外灯254 nm和365 nm两个不同的波长下，比较了天然茯苓和液体发酵茯苓薄层层析图谱。从薄层层析图谱分析中，发现通过不同培养方法获得的茯苓在三萜类化合物的薄层层析图谱有较大的相似性。同时，也发现液体发酵茯苓三萜类化合物种类比天然茯苓三萜类化合物种类更多(见图3、4)。

　　2.3 茯苓粉末总糖

　　天然茯苓粉末茯苓总糖不低于80.0%.液体发酵茯苓粉末茯苓总糖不低于40.0%.

　　2.4 茯苓粉末水溶性多糖和碱溶性多糖

　　2.4.1 天然茯苓粉末水溶性多糖和碱溶性多糖 水溶性多糖不低于1.5%，碱溶性多糖不低于75.0%.

　　2.4.2 液体发酵茯苓粉末水溶性多糖和碱溶性多糖 水溶性多糖不低于5.0%，碱溶性多糖不低于15.0%.

　　2.5 茯苓粉末灰分

　　2.5.1 茯苓粉末总灰分 天然茯苓粉末总灰分不得超过4.0%;液体发酵茯苓粉末总灰分不得超过8.0%.

　　2.5.2 茯苓粉末水溶性灰分 天然茯苓粉末水溶性灰分不得超过2.0%;液体发酵茯苓粉末水溶性灰分不得超过2.0%.

　　2.5.3 茯苓粉末酸不溶性灰分 天然茯苓粉末酸不溶性灰分不得超过2.0%;液体发酵茯苓粉末酸不溶性灰分不得超过2.0%.

　　2.6 茯苓粉末氨基酸

　　天然茯苓粉末氨基酸总量不低于1.0%;液体发酵茯苓粉末氨基酸总量不低于20.0%.

　　3 讨论

　　天然茯苓粉末和液体发酵茯苓粉末在显微特征、三萜类化合物、多糖、灰分和氨基酸含量等方面均存在较大的差异。其主要原因可能是由于生产天然茯苓和液体发酵茯苓的发酵培养基和发酵培养方式不同，使天然茯苓和液体发酵茯苓在代谢方式和代谢产物方面产生较大的差异，从而最终使其在显微特征、三萜类化合物、多糖、灰分和氨基酸含量等方面均产生较大的差异。因此，笔者根据天然茯苓和液体发酵茯苓各自显微特征和所含化合物成分，制定了各自的质量标准。

　　通过对天然茯苓和液体发酵茯苓所含三萜类化合物仅通过薄层层析进行了比较，尚未进行含量测定。另外，未对天然茯苓和液体发酵茯苓中微量元素的种类和含量进行研究。今后，将在上述方面进一步展开天然茯苓与液体发酵茯苓的研究。随着对天然茯苓和液体发酵茯苓研究的深入，将建立更加完善的天然茯苓与液体发酵茯苓的质量标准，以推动天然茯苓和液体发酵茯苓的开发利用。

参考文献

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　　[2] 蔡丹凤，王雪英，林佩瑛，等.松树蔸栽培茯苓新技术[J].中国食用菌，2007，26(5):2931.

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