雷公藤多甙及雌孕激素治疗对大鼠卵巢Bcl2和Bax表达的实验研究

　　　　 作者：姜姣姣， 郝丽， 王瑞峰， 黄婷， 袁亮， 徐星铭， 卢文

【摘要】 目的 探讨雷公藤多甙(TWP)致雌性大鼠生殖系统损害机制及防治方法。方法 取50只SD雌性大鼠随机分为对照组，雌孕激素干预组(干预组)，雌孕激素治疗组(治疗组)，恢复组和雷公藤组。运用放免法测定血清性激素水平的变化，HE染色观察卵巢组织变化，免疫组化染色法检测卵巢组织颗粒细胞凋亡蛋白Bcl2和Bax的表达水平。结果 与对照组相比，雷公藤组和恢复组大鼠血清黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)水平明显升高，雌激素(E2)的分泌明显下降，且差异有统计学意义(P值均&<0.05);卵巢组织明显受损，各级卵泡明显减少，卵泡闭锁较多，干预组各指标则无明显改变;大鼠颗粒细胞凋亡蛋白Bcl2的表达在雷公藤组明显低于对照组，而干预组及治疗组均高于雷公藤组;Bax蛋白在各组的表达则相反(P&<0.01)，其中干预组与对照组无明显差异(P&>0.05)。结论 TWP可致雌性大鼠生殖系统的损害，雌孕激素替代治疗对卵巢功能有较好的保护作用，其机制可能与Bcl2蛋白表达上调以及Bax表达下调有关。

【关键词】 雷公藤; 生殖系统; 激素替代

　　　　 【Abstract】 Objective To explore the protective effects of estrogenprogestogen replacement therapy (HPT) on impaired genital system induced by tripterygium wilfordii polyglycosidium (TWP) in female rats and its mechanism.Methods 50 SD female rats were randomly pided into five groups:control group，intervention group，treatment group，recovery group and TWP group.The levels of serum gonadal hormone were detected by radioimmunoassay.The histological changes of the ovary were observed after HE staining.Using the immunohistochemical staining technique we detected the expression levels of apoptosis regulatory protein Bcl2 and Bax in ovarian granular cell.Results The level of E2 secreted by ovary was lower and the levels of LH and FSH secreted by pituitary were higher in TWP group and recovery group than those in control group(P &<0.05) and there were no significant differences in levels of these three hormones between control group and intervention group (P &> 0.05).In TWP and recovery group，ovarian tissues were significantly injured with obvious decreasing of ovarian follicles at different stages and more clausura of these follicles.Compared with control group，estrogen replacement therapy combined with progestogen could restrain these pathological changes induced by TWP.In TWP group，Bcl2 expression in ovary cells of rats was lower than that in control group，but in intervention group and treatment group，it was obviously higher than that in TWP group.However，Bax expression showed the contrary changes at the same time in each group (P &<0.01) and there was no significant difference in Bax expression between control group and intervention group (P&>0.05).Conclusion HPT can prevent ovary injury induced by TWP.Its mechanism may be partly related to up regulation of Bcl2 expression and downregulation of Bax regulation.【Key words】 tripterygium wilfordii; genital system; hormone replacement therapy

　　雷公藤多甙(tripterygium wilfordii polyglycosidium，TWP)是从祖国医学宝库中挖掘出的一种疗效显著，用途广泛，极有发展前景的中药制剂，其作用类似肾上腺皮质激素却没有激素的副作用，作为基本免疫抑制剂药物广泛应用于各种原发和继发性肾炎以及肾移植的抗排异等治疗[1，2]。 但其对女性卵巢的毒副作用极大地影响了该药的广泛应用[3]。已有研究表明[4]，雌、孕激素序贯性干预治疗(HPT)能够改善TWP致育龄期女性卵巢功能减退或衰竭引起的围绝经期征候群，使子宫有规律性地撤退性出血，维持血清中E2，FSH和LH的正常水平。为了进一步探讨其作用机理，该研究通过动物实验，从影响颗粒细胞凋亡的角度初步探讨其疗效机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物成年雌性SD大鼠50只，16周龄，体重200～250 g.普通级，由安徽医科大学第一附属医院实验动物中心提供。

　　1.2 药物、试剂与仪器雷公藤多甙(上海复旦复华药业有限公司);戊酸雌二醇(补佳乐:法国先灵公司生产，由广州先灵药业有限公司分包装);醋酸甲轻孕酮片(上海华联制药有限公司);Bcl2和Bax蛋白表达免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司;Nikon彩色数码CCD摄像头(Diagbstic Camera DXM1200F)、Metamorph生物图像软件等。

　　1.3 分组与给药50只雌性SD大鼠，随机分为5组，正常对照组，雌孕激素干预组(干预组)，雌孕激素治疗组(治疗组)，恢复组和雷公藤组，共观察16周。正常对照组:每日生理盐水灌胃;干预组:每日以TWP 12 mg/kg灌胃，同时用戊酸雌二醇(补佳乐，HPT)0.12 mg/kg，至第4 d，加用醋酸甲轻孕酮片0.96 mg/kg 1 d，每个疗程4 d，两药同时停用1 d后重复下一疗程[5，6];治疗组:每日以TWP 12 mg/kg灌胃，12周后改用HPT，4周后停用;恢复组:每日以TWP 12 mg/kg灌胃，12周后停用TWP，继续喂养4周;雷公藤组:每日以 TWP 12 mg/kg灌胃，12周后处死并留取标本。每周称体重调节给药量。

　　1.4 标本采集与制备处死前进行阴道细胞学检查，选择非动情期大鼠称重，采用10%水合氯醛麻醉，用消毒处理的手术器械剖腹取双侧卵巢，4%的多聚甲醛固定，脱水透明，常规石蜡包埋切片，切片4 μm厚，捞片于涂有多聚赖氨酸玻片上，60℃烤箱内过夜备用。分别做HE染色和免疫组化染色。

　　1.5 血清性激素的测定每只大鼠在处死前，颈动脉取血，静置2 h后2 500 r/min离心5 min，取血清，采用放射免疫法测定血清中雌激素(E2) 、黄体生成素(LH) 和卵泡刺激素(FSH) 的水平。

　　1.6 化学染色采用免疫组织化学方法(SP)检测Bcl2和Bax蛋白的特异表达，实验步骤按试剂说明书进行。将石蜡切片常规脱蜡脱水，滴加Bcl2和Bax特异性抗体，苏木素复染，DAB显色。用PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察并摄片。

　　1.7 计算机图像分析在200倍、400倍光镜下观察染色结果。400倍光镜下利用Nikon彩色数码CCD摄像头捕获各组免疫组化染色切片中Bcl和Bax的图像，利用Metamorph生物图像软件进行结果处理。用平均光密度值(OD值)判定结果。

　　1.8 统计分析采用SPSS 12.0统计软件进行统计分析，所有数据均用±s表示，方差齐的定量资料各组间比较采用ANOVA方差分析，各组间之间的比较采用LSD法，检验水准皆为0.05.

　　2 结果

　　2.1 血清性激素变化与对照组相比，干预组性激素水平变化无统计学差异，而雷公藤组和恢复组卵巢分泌E2显著减少，垂体分泌的FSH和LH则明显升高，性激素变化有统计学意义。雷公藤组与恢复组大鼠性激素水平变化均无统计学意义。与干预组比较，治疗组、恢复组和雷公藤组大鼠的E2分泌减少，FSH和LH分泌增多，且差异有统计学意义(见表1)。　表1 各组大鼠血清性激素水平的比较

　　2.2 HE染色结果对照组镜下可见各级卵泡生长活跃，结构清晰，有多个发育良好的黄体;干预组与对照组相似;治疗组可见部分卵泡卵母细胞消失;恢复组和雷公藤组各级卵泡含量较少，可见多个闭锁卵泡，表现为卵母细胞萎缩或消失，卵泡颗粒细胞塌陷，胞质成空泡状，尤其是雷公藤组，部分卵泡卵母细胞及卵泡细胞均消失，结缔组织增生。

　　2.3 Bcl2和Bax表达的免疫组化检测结果Bcl2与Bax蛋白在各组大鼠的卵巢组织中均有表达，主要表达在卵巢颗粒细胞胞浆中，多以棕色，深棕色着色为主。结果判定用平均光密度表示。在Bcl2蛋白表达上，对照组明显高于其它各实验组，而雷公藤组明显低于其它组，且差异具有统计学意义(P值均&<0.01);治疗组与干预组比较无明显差异(P&>0.05)。在Bax蛋白表达上，雷公藤组明显高于对照组、干预组和治疗组;而对照组明显低于治疗组、恢复组和雷公藤组(P值均&<0.01)，而与干预组无明显差异(见表2及图1、2)。表2 各组大鼠颗粒细胞凋亡相关蛋白Bcl2与Bax平均光密度的比较

　　3 讨论

　　TWP是从雷公藤(根木质部碎片)中提取的具有免疫抑制活性的物质[7]，自从1977年著名肾脏病专家黎磊石院士首先将雷公藤用于临床治疗肾小球疾病以来，至今已20多年，其抗炎、抗肿瘤、免疫调节及抗生育等作用已逐步被认识。尤其是在肾小球疾病的治疗和基础研究中发现，雷公藤不但可以改善肾小球毛细血管壁的通透性，减少蛋白尿，而且可以减轻肾组织的病理变化。雷公藤的上述作用，类似肾上腺皮质激素却没有激素的副作用，不同于现有其它免疫抑制药物的新型免疫抑制剂，它的作用方式独特，且多靶点作用，疗效好，适应范围广，因此在肾脏病领域中有着广阔的应用前景。但是TWP具有细胞毒作用，对生殖较快的细胞毒副作用明显，女性卵巢即是其作用的靶器官之一，可出现药物性闭经、不孕甚至卵巢早衰等。有报道雷公藤的自身免疫治疗剂量明显高于其有效抗生育阈剂量[8]，表明雷公藤在发挥免疫抑制作用的同时，不可避免地影响到生殖功能。该研究亦发现，雷公藤组和恢复组大鼠E2分泌明显减少，血清FSH、LH水平较高，光镜下可见多个闭锁卵泡，各级卵泡明显减少，黄体退化萎缩，可见较多的结缔组织增生，说明TWP对生殖系统有明显的损害，而且短期内很难自然恢复。卵巢中贮存卵泡数目的多少和卵泡闭锁速度决定卵巢功能衰竭时间的早晚。卵巢卵泡的闭锁受细胞凋亡的调控，其中颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要机制。如果在一个发育的卵泡中10%以上的颗粒细胞发生凋亡，则表明该卵泡已经或正在闭锁，而且卵泡一旦进入闭锁就不能再回到正常的发育周期[9]。因此，若能在一定程度上减少甚至阻止颗粒细胞的凋亡，对在一定程度上防治卵泡闭锁和黄体退化，避免卵巢早衰和维持女性下丘脑垂体卵巢轴功能有着重要的意义。参与细胞凋亡调控的重要基因有p53、Bcl2、Bax等。在鼠类卵巢中决定细胞存活的关键因素是Bcl2/Bax比值的大小，Bcl2 基因是抑制凋亡基因，Bax表达增加将促发凋亡[10]。Bax基因自身形成同源二聚体或与Bcl2 形成异源二聚体，Bcl2 表达大于Bax 表达时，Bcl2 与Bax 的异源二聚体增多，细胞趋于存活;Bcl2 表达小于Bax 表达时，则Bax 本身形成同源二聚体占主导，细胞趋于凋亡[11]。有实验研究表明，这两种基因的表达受到了雌、雄激素直接或间接的影响。其中，雌激素上调Bcl2表达，下调Bax表达，能够抑制颗粒细胞凋亡[12]。该实验根据正常大鼠的生理周期和体内性激素水平的变化[13]，在应用TWP的同时采用HPT，研究结果显示:与雷公藤组相比，干预组和治疗组能明显上调抑制凋亡因子Bcl2蛋白的表达，下调促凋亡因子Bax蛋白的表达，光镜下亦可见各级卵泡生长活跃，闭锁卵泡较少;提示:HPT上调Bcl2蛋白的表达及下调Bax蛋白的表达可能是其抑制卵泡颗粒细胞凋亡的重要机制，但其详细机制还有待进一步研究。值得一提的是，干预组大鼠Bax蛋白的表达和性激素水平的变化与对照组相比无明显差异(P&>0.05)，对卵巢功能的保护作用强于治疗组。提示对接受TWP治疗的病人，早期监测及雌孕激素干预治疗十分必要。总之，HPT对TWP所致雌性大鼠卵巢损伤有较好的保护作用，机制可能与其上调抑制凋亡因子Bcl2蛋白的表达，下调促凋亡因子Bax蛋白的表达有关。

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