应用基因芯片研究E2F1过表达对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响

　　　　 作者：王晓通 李雷 肖强 谢玉波 王长青

【摘要】 目的 利用基因表达谱芯片技术筛选过表达E2F1的胃癌MGC803细胞与对照组间差异表达的免疫相关基因，初步探讨E2F1对胃癌细胞免疫功能影响的机制。方法 分别抽取转染E2F1的胃癌MGC803细胞和未转染E2F1的胃癌MGC803细胞的总RNA.纯化mRNA，逆转录合成cDNA标记后，与22K人类基因表达谱芯片进行杂交，扫描后筛选出与免疫相关的差异表达基因，半定量RTPCR方法验证差异表达基因。 结果 在21 522条基因中，两组细胞间差异表达的免疫相关基因有10条，其中上调基因2条，下调基因8条。上调基因中有1条功能信息不明。其中myc的RTPCR结果与基因芯片扫描结果相似，具有相同的方向性。结论 利用基因芯片技术筛选出E2F1过表达影响胃癌细胞免疫功能的相关基因，为今后更深入的研究E2F1对胃癌免疫功能的影响奠定了基础。

【关键词】 胃癌; E2F1; 基因表达谱芯片; 免疫相关基因

　　　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of E2F1 overexpression on immunityrelative genes of gastric carcinoma MGC803 cells by cDNA microarray technique and to explore the mechanism of E2F1 affecting immune functions of gastric cancer. Methods The total RNA was extracted from gastric cancer cell line MGC803 transfected with E2F1 or those control cells without transfection and then purified. The cDNA was obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR)， and then labeled with fluorescence as probes， which were hybridized with gene chip containing human 22K gene expression profile. Subsequently， the signal images were scanned by LuxScan 10K/A dual pathways laser scanner and analyzed by LuxScan3.0 image analysis software. The semiquantitative RTPCR was used to confirm the array results. Results Of the 21522 target genes， 10 genes were screened out for differences in immunityrelative gene expression level. Two of the 10 genes were upregulated and 7 were downregulated. The function of a differentially expressed gene was unknown. The result of RTPCR was coincided well with the cDNA microarray results. Conclusion Ten immunityrelative genes in gastric cancer cells are found by using gene chip， which provides a basis for further investigation of the effects of E2F1 on immune function of gastric cancer.【Key words】 gastric adenocarcinoma; E2F1; gene expression profile; immunityrelative genes

　　胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近20年来呈明显上升的趋势，严重危害了人类的生命健康[1]。当胃癌进展时，肿瘤细胞常通过促进免疫细胞的凋亡或者降低其功能而获得免疫赦免，达到免疫逃逸的目的。肿瘤与机体相互作用的局部微环境，特别是免疫微环境，对肿瘤的发生、发展和转移有着重要的影响[2]。体外细胞培养和动物实验证实，E2F1作为细胞转录的重要调节因子和众多基因转录的启动子，对肿瘤的生长具有抑制作用[3，4]，但对其免疫功能的影响尚未见报道。本实验采用基因芯片技术筛选E2F1过表达的胃癌细胞与对照组之间差异表达的免疫相关基因，初步探讨E2F1过表达对胃癌细胞免疫功能影响的机制。

　　王晓通，等.应用基因芯片研究E2F1过表达对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响

　　成都医学院学报2009年9月，4(3)

　　1 材料与方法

　　1.1 实验细胞人胃癌MGC803细胞株购自中国科学院上海生物细胞研究所，稳定过表达E2F1的胃癌细胞株(MGC803/E2F1)由本实验室构建[3]。

　　1.2 主要试剂及仪器Trizol(Invitrogen)，基因表达谱芯片采用博奥生物公司提供的22K人类基因组寡核苷酸芯片，LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 总RNA抽取及纯化 Trizol一步法提取MGC803/E2F1细胞和未转染E2F1的胃癌MGC803细胞的总RNA.

　　1.3.2 芯片扫描及数据处理 送博奥生物有限公司检测制备。芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描。采用LuxScan3.0图像分析软件(CapitalBio公司)对芯片图像进行分析。先把图像信号转化为数字信号，根据cy5和cy3总体信号的global mean对各芯片进行片间线性校正;然后对芯片上的数据用Lowess方法[5]进行归一化;最后以差异为2.0倍的标准，即Cy5/Cy3比值(Ratio)&>2.0或&<0.5作为阳性结果，来确定差异表达基因。

　　1.3.3 基因芯片质量控制 Hex、外标、内标等阳性对照信号正常，阴性对照检测为阴性;片内看家基因重复性好，Ratio值CV不超过0.3;无影响数据的污染，漏点率不超过3‰，检测率正常。

　　1.3.4 myc实时半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR) 采用上述方法抽提MGC803/E2F1细胞和MGC803细胞总RNA，贮存于-80℃冰箱。设计myc引物，上游：5'CGCCCAGCGAGGATAT3'，下游： 5'TGGAGGTGGAGCAGACG3'.内参照基因为GAPDH.取4 μl PCR产物经1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像获取的图片，经Quantity One v462软件对E2F1基因与其内参进行灰度比值半定量比较，得出结果后在两组间再进行相互比较。

　　2 结果

　　2.1 总RNA纯度及完整性鉴定胃癌MGC803细胞中提取总RNA结果良好， 两组细胞总RNA含量均在80 ～170 μg之间，采用电泳图谱分析有清晰的28 S 和18 S 条带，表明提取到所需高纯度RNA，可满足后续实验需要。

　　2.2 基因芯片结果

　　2.2.1 MGC803细胞组和MGC803/E2F1细胞组杂交信号结果 全部阳性对照信号清晰，阴性对照信号很弱，证明实验数据可靠。

　　2.2.2 生物信息学分析结果 根据以上判断标准，生物信息学分析结果显示：胃癌MGC803细胞组和MGC803/E2F1细胞组之间差异性表达基因740条，其中表达上调的差异性基因405条，下调基因335条，差异性表达基因中功能信息不明的有73条。进一步的Pathway分析显示，在GeneMapp、KEGG和Biocarta数据库中涉及免疫相关的基因有10条(见表1)。表1 与免疫有关的差异表达基因

　　2.3 差异表达情况结果选取免疫相关差异表达基因myc，在MGC803/E2F1和MGC803细胞中进行半定量 RTPCR检测，结果表明，此基因在mRNA水平存在与22K人类基因组寡核苷酸芯片检测相似的差异表达情况(见图1、2)。

　　3 讨论

　　基因芯片是伴随着人类基因组计划发展起来的一项高通量筛选技术，具有低消耗、高灵敏度的特点。目前应用该技术检测肿瘤相关基因的差异表达已成为肿瘤研究的热点，并已广泛应用在疾病尤其是肿瘤的基因表达谱分析，进而成功地应用在肿瘤相关基因功能研究方面[6]。本实验采用人类22K基因表达谱芯片技术分析过表达E2F1的胃癌MGC803细胞与对照组之间的差异基因。结果显示：涉及免疫相关的差异表达基因有10条，其中上调基因2条，下调基因8条。上调基因中有1条功能信息不明。经实时半定量RTPCR对myc基因的差异表达倍数进行验证，结果与基因表达谱芯片扫描结果相似。胃癌是一个长期的多因素作用、多基因参与的疾病[7]，其发生、发展与宿主抗肿瘤免疫功能状态密切相关。有研究表明，胃癌发生常伴有宿主免疫功能低下或者处于免疫抑制状态，因此肿瘤对宿主免疫系统产生逃逸[8]。E2F1细胞转录活化因子是细胞周期最重要的转录因子之一，对肿瘤的发生发展有着重要的作用。我们前期的研究显示：E2F1过表达可在体外抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭能力[9]。有研究表明：在平滑肌肉瘤和非小细胞肺癌裸鼠模型的肿瘤实质内注射带有E2F1片段的腺病毒，可观测到实验组的肿瘤体积比对照组明显缩小[4，10]。由此可见，E2F1对肿瘤的生长具有抑制作用，但其作用机制尚无定论，极有可能是通过影响某些与免疫相关癌基因的表达所致。本实验结果提示了这一点。myc是差异表达的10条免疫相关基因中最引人注目的一条。myc基因是细胞原癌基因之一，与细胞的增殖、分化、凋亡、细胞周期的调控密切相关，在大多数恶性肿瘤细胞中可检测出myc的扩增或过表达[11]。同时，myc与免疫系统的关系也非常密切。在淋巴细胞终末分化或当淋巴样细胞成为记忆淋巴细胞时，它是下调的，而在大部分免疫性疾病发病的早期，myc的重排是最重要的事件之一，它导致淋巴样细胞保持持久的增殖状态，通过细胞周期广泛地影响细胞进展、分化、凋亡和粘附[12]，最终破坏淋巴细胞的正常功能或形成淋巴瘤。有研究表明：myc基因和其他基因的共同作用可引发儿童免疫系统癌——B细胞淋巴瘤[13]。而E2F1恰好是myc的靶基因，可以被myc所激活[14]。本实验中myc表达下调，提示E2F1的过表达可通过负反馈机制抑制myc的表达，促使免疫细胞功能恢复正常，从而抑制肿瘤的生长。在其余的9个与免疫有关的差异基因中，绝大部份已阐明与免疫细胞的发生发展密切相关，如fos，它是由原癌基因fos编码的一种转录因子，与另一种原癌基因的产物jun形成复合体，在转录水平调节靶组织的基因表达[15]。Ohkubo等[16]研究表明，fos过度表达能使小鼠生发中心缺乏，主要机制是原癌基因fos可诱导B淋巴细胞凋亡，抑制B淋巴细胞生发中心的形成，破坏B淋巴细胞终末分化的调节，最终使B淋巴细胞正常发育受到破坏，免疫系统受到抑制。但它与E2F1之间的联系有待进一步的研究。另外，在本次实验中上调倍数最大的是在GeneBank中命名为alcam(Oligo_ID为h300001892)的基因，目前功能尚不明确，继续对其进行研究可能会揭示出新的信号通路。总之，在胃癌的进展过程中，E2F1过表达能使众多基因的正常表达发生改变，通过不同的信号传导通路最终导致了胃癌细胞生物学行为发生改变。继续对本研究结果中的免疫相关差异基因进行深入研究将有助于阐明E2F1影响胃癌免疫学方面的分子机理，进而为胃癌的免疫治疗提供新的思路和新的方法。

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