雷公藤甲素对兔血管平滑肌细胞增生和凋亡的影响

【摘要】 目的 研究雷公藤甲素(TP)是否具有抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖并诱导其发生凋亡的作用，为临床开发新型药物洗脱支架提供实验依据。方法 主动脉SMCs体外培养和流式细胞仪检测，DNA凝胶电泳。结果 TP组与阳性对照地塞米松相比，凋亡率有显著提高;TP干预组凝胶电泳谱型呈凋亡特征性梯状条带。结论 TP可抑制指数生长期SMCs增殖并诱导其凋亡。

【关键词】 雷公藤甲素; 血管平滑肌细胞; 细胞凋亡

　　【Abstract】 Objective To access the effects of triptolide on the proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells(VSMCs)，and to screen a new drug for the drugeluting stents.Methods Aortal SMCs were cultured in vitro and their cell cycles were detected by flow cytometry.DNA gel electrophoresis was carried out to measure its spectral pattern.Results The apoptosis rate in triptolide group was significantly higher than that in the positive group.DNA ladders were also found in the treated groups.Conclusion This study demonstrates that triptolide can inhibit the proliferation and induce apoptosis in VSMCs.

　　【Key words】 triptolide;vascular smooth muscle cells;apoptosis

　　雷公藤甲素(triptolide，T 10单体，TP)是雷公藤的主要活性成分之一，属活性最高的环氧化二萜内酯化合物[1]。本研究运用体外细胞培养、流式细胞仪及DNA凝胶电泳等技术，观察雷公藤甲素对兔主动脉SMCs细胞周期进程的影响，了解其是否诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)发生凋亡。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　雷公藤甲素水溶剂(福建省医学科学研究所提供);IMDM培养基(GIBCO，公司);胎牛血清(杭州四季清生物技术材料研究所);胰蛋白酶(DIFCO公司);细胞增殖WST1试剂盒(ROCHE);碘化丙啶(PI，Kirkegaard && Perry Laboratories)，水平电泳槽(DYCP31D型，北京市六一仪器厂);全自动数码凝胶成像及分析系统(GENEGENIUS，SYNGENE公司);流式细胞仪(FACScan，BECTON DICKINSON)。

　　1.2 动物

　　成年的纯种新西兰大白兔，每次实验用1只，体重2～3 kg，雌雄不限。

　　1.3 方法

　　1.3.1 主动脉SMCs的培养 取新西兰白兔胸腹主动脉，无菌分离主动脉中膜，按贴块法分离，培养VSMCs，0.125%胰蛋白酶消化传代，实验选用第3～4代SMCs，以含体积分数为20%胎牛血清的IMDM培养基培养的SMCs为指数增殖期细胞，经含体积分数为0.5%胎牛血清的IMDM培养基培养的SMCs为静止期细胞。培养的细胞经相差显微镜形态学特征观察及抗肌动蛋白单克隆抗体免疫细胞化学染色证实为SMCs，无内皮细胞、成纤维细胞污染。

　　1.3.2 活细胞计数 细胞培养在6孔培养板上，每孔加液3 ml.细胞经 1×10-5mol/L雷公藤甲素分别作用1、3和7 d后终止培养。用0.125%胰蛋白酶消化分散细胞，使之悬浮在PBS液中，取100 μl用血球计数板和台盼蓝染色进行细胞计数。拒染细胞为活细胞和凋亡细胞，蓝染细胞为坏死细胞和细胞膜通透性增加的凋亡晚期细胞。

　　1.3.3 WST1 ELISA法测定细胞WST1代谢活性 传代的血管平滑肌细胞按5×105/ml的密度接种在96孔板上，每孔加液100 μl.每次实验设2个空白对照孔(以IMDM培养液代替细胞)。细胞经雷公藤甲素、地塞米松分别作用7 d后，加入即用型WST1溶液，置CO2培养箱孵育3 h后，振荡1 min在酶标仪450/655 nm双波长处检测OD值。

　　1.3.4 细胞周期分析 血管平滑肌细胞培养在50 ml培养瓶中，每瓶加液5 ml.加入最适作用浓度的雷公藤甲素、地塞米松作用7 d后，经0.125%胰蛋白酶将细胞消化成单细胞悬液，用PBS离心洗涤细胞2次。加入0.5 ml　PBS将细胞吹打悬浮起来，用吸管将细胞悬液喷射入5 ml 75%预冷的乙醇以固定细胞，封口后置4℃冰箱储存待测。检测时用PBS洗去乙醇，RNA酶37℃作用20 min，碘化丙啶(PI)染色30 min，在流式细胞仪上进行检测，Multiple Option Cell Cycle Fitting(Autofit Version 2.53)软件分析细胞周期。

　　1.3.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 上述药物作用细胞7 d后，离心弃上清液，经过抽提形成絮状物，最后溶于20 μl TE.取10 μl样品在琼脂糖凝胶电泳3～4 h，紫外灯下观察，拍照。

　　1.4 统计处理

　　所有数据以均值±标准差表示，采用方差分析比较各组间差异，以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 雷公藤甲素对血管平滑肌细胞数量及代谢活性的影响

　　表1所示，1×10-5mol/L雷公藤甲素作用于VSMCs 7 d后，与空白对照组及阳性对照地塞米松组相比，1×10-5mol/L雷公藤甲素组WST1代谢活性明显减低(P&<0.01)。表1 雷公藤甲素作用7 d后对血管平滑肌细胞增殖作用的抑制

　　2.2 雷公藤甲素对SMCs细胞周期的影响

　　雷公藤甲素属于周期非特异性药物，但对S期细胞敏感，敏感顺序为S&>G2/m&>G0/G1，主要作用于间期细胞。指数生长期SMCs(20%胎牛血清组)加入1×10-5mol/L雷公藤甲素作用7 d后，G0/G1期细胞比例显著下降，而S期细胞比例显著增高，雷公藤甲素组与阳性对照地塞米松组相比，凋亡率有显著增高(见表2)。表2 雷公藤甲素作用7 d后对血管平滑肌细胞细胞周期的影响

　　雷公藤甲素干预的血管平滑肌细胞的凝胶电泳谱型均呈凋亡特征性“梯状”图谱(ladder)，与标准相对分子质量参照物(marker)相比，ladder中条带的相对分子质量为180～200 bp的整倍数。未发生凋亡的对照组只出现1条距加样孔很近的大分子条带。

　　3 讨论

　　血管平滑肌细胞(VSMCs)是由胚胎间充质细胞分化发育而成的，从出生到成年，VSMCs要经历由合成表型到收缩表型，由增生活跃到生长静止等一系列变化，从而完成发育[2]。在高血压、冠状动脉成型术后再狭窄以及动脉粥样硬化等病变中，均可见到血管平滑肌细胞的表型转变和血管平滑肌细胞的异常增殖，表型转化是VSMCs增殖的先决条件[3]。

　　本实验资料显示:雷公藤甲素作用后，光镜下SMCs出现凋亡的形态学改变，细胞皱缩，核染色质固缩，聚集至核膜下，凋亡小体形成。流式细胞仪检测，药物作用后指数生长期SMCs细胞周期中凋亡峰增高，DNA凝胶电泳证实了细胞发生凋亡。从形态学、细胞学和分子生物学几个方面提供证据表明雷公藤甲素可以诱导指数生长期兔SMCs凋亡[4]。

　　目前TP诱导细胞凋亡的机制还未完全阐明，以往的一些实验提示，在TP诱导VSMCs凋亡的作用机制中，免疫调节作用较抑制作用更为重要，并可能与下列变化有关:①通过阻断p53介导的p21诱生来使细胞对拓扑异构酶抑制剂敏感性增加[5];②TP阻断NKkB激活，使对TNFα有耐药性的细胞系对TNFα诱导的凋亡变敏感;③TP抑制TNFα介导的cIAP2(hiap1)和 cIAP1(hiap2)产生，而此二者是凋亡抑制剂(IAP)家族的成员[6]。在TP干预过的细胞中，p53表达增加[7]，p53转录被抑制[8]，p53应答基因p21(waf1/cif1)下调[9]，细胞阻滞在S期。

　　经皮经腔冠脉介入术(percutaneous transluminal coronary intervention，PCI)已经成为治疗冠脉疾病最常用的治疗方法。但术后再狭窄发生严重限制了PCI的发展[10]。术后再狭窄发生的主要原因是:血管壁弹性回缩和血管内膜增生[11]，其中血管损伤后平滑肌细胞迁移至内膜并增生[12]是PCI术后再狭窄的关键环节[13]。本实验显示，雷公藤甲素可抑制指数生长期SMCs增殖并诱导其凋亡，而且其作用较地塞米松明显增强，为从抗增殖、抗炎、诱导凋亡角度寻找抗血管平滑肌过度增殖的药物提供了实验依据。

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