【摘要】 目的 研究根据川芎的成分人工合成的阿魏酸哌嗪超细化后的特性。方法 采用搅拌式高能球磨机并以水冷和液氮冷却的方式进行研磨。结果 阿魏酸哌嗪达到20 nm左右，粉碎后成分较稳定，颗粒极易团聚，可形成乳液，其水溶性并无明显改善。结论 阿魏酸哌嗪纳米化后结构不变，无增溶现象，可将其制成纳米微囊，用作口服药或注射剂。
【关键词】 阿魏酸哌嗪; 球磨机; 纳米颗粒; 水溶性
【Abstract】 Objective To study the synthesis characteristic of piperazini ferulas superfine comminuted from the component of Ligusticum ChuanXiong.Methods High energy ballmilling machine by means of mix round was used to grind piperazini ferulas during the process of water cooling circulating and liquid nitrogen cooling.Results Piperazini ferulas was comminuted to particles about 20 nm.In XRD analysis，neither its crystallite changed，nor a new element appeared.The comminuted particles were very easy to reunite.Conclusion Watersolubility of piperazini ferulas does not change after the particles are superfinely comminuted.It might be used to made nanometersize packing capsule colloid for serving the purpose of oral administration drug and injection.
【Key words】 piperazini ferulas;ballmilling machine;nanometersize granule;watersolubility
阿魏酸哌嗪(piperazini ferulas)是根据川芎的成分人工合成的新药[1]。川芎中的阿魏酸(Ⅰ)和川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP，Ⅱ)都具有明显的活血化淤作用[24]。哌嗪(Ⅲ)的结构类似川芎嗪结构中的吡嗪，国内外治疗心脑血管疾病药物的化学结构中，许多都含有哌嗪结构部分，国内已合成阿魏酸哌嗪盐(Ⅴ)，初步的药理实验证明，它的作用比阿魏酸和川芎嗪强。阿魏酸的衍生物阿魏酸哌嗪的药理学研究表明，该药物吸收迅速，在血液中大部分以游离形式存在，易于透过生物膜，在体内转移快，不易导致蓄积。毒理学研究表明，该药毒性低，无致畸和致突作用，用于治疗脑梗死、冠心病、心绞痛、血栓闭塞性脉管炎等均有良好效果[58]，对慢性肾小球疾病、肾病综合征Ⅱ型和慢性肾功能衰竭也取得较好的近期疗效[913]。由于阿魏酸哌嗪在水中微溶，在乙醇中极微溶解，因而目前阿魏酸哌嗪都是以口服方式给药，使其在临床急救方面受到一定的限制。目前的研究结果表明，尺寸小于10 nm的超细微粒可以在血管中自由移动，根据这一特性，可以将药物制成纳米粒子注入到人体的各个部位，检查病变。又有报道，分子量小于1 000的物质，可以超细到20 nm仍保持其原有结构，而阿魏酸哌嗪的分子量是474，因此对其纳米化不影响结构，而有的物质纳米化后可以由疏水性变为亲水性。通常认为中药防病治病的物质基础来自生物活性成分或活性化学组分，因此人们的注意力主要集中在寻找具有各种生物活性的化合物。但不容忽略的是，生物机体对药物的吸收、代谢是一个复杂的过程，中药制剂产生的药理效应不能仅仅归之于药物特有的化学组成，还与该制剂的物理状态密切相关[7]。因此，改变药物制剂的物理状态是新药研制的一种有效方法。本研究探索应用物理方法使其超细化或纳米化后，在不改变其结构和药效的前提下，利用物质的纳米特性使其增溶或制成假溶液，通过快捷、低成本和安全的方式制成注射剂，从而更方便用于临床。
1 材料与方法
1.1 原料及球磨处理
采用阿魏酸为原料合成阿魏酸哌嗪盐(成都市药剂研究所提供)。以阿魏酸哌嗪颗粒细化为主要目的，采用搅拌式高能球磨机，使用玛瑙球进行研磨;为避免阿魏酸哌嗪在球磨过程中发生高温变性，球磨工艺采用低能输入的方式(300 r/min)以及外部强制冷却。具体球磨工艺分为循环水冷(20℃)和液氮强冷(-196℃)两种。
1.2 粒度分析与电镜观察
采用英国马尔文仪器有限公司生产的纳米粒度及Zeta电位分析仪(测量范围为2～3 000 nm)对原样和不同处理工艺的颗粒进行粒度分析，测定其粒度分布曲线。采用透射电子显微镜(HRTEM)观察阿魏酸哌嗪颗粒的形貌和粒度分布直观特征。均采用标准方法制样。
1.3 结晶形态分析
采用X射线粉末衍射(Philips Analytical KAlphal λ=0.15418 nm)方法分析阿魏酸哌嗪粉体高能球磨过程中可能出现的晶型转变与异质相。
1.4 水溶解性实验分析
依据四川药品92版标准行水溶解实验分析。
2 结果与讨论
图1示阿魏酸哌嗪原样透射电镜图像，图2和图3是阿魏酸哌嗪经过搅伴式高能球磨后颗粒的透射电镜照片，由颗粒形貌可以看出:原样粉末颗粒以不太规则的短杆状为主，部分颗粒的长径比约为1，呈球状，粒度基本处于亚微米级或者微米级。循环水冷条件下(图2)高能球磨颗粒基本呈球形，边界光滑，直径多处于10～20 nm，个别小于10 nm或者大于20 nm。从整体上看，粉末粒度分布范围较窄，细化效果比较好。液氮冷却条件下(图3) 高能球磨颗粒外形同水冷条件下相似，但粒度分化比较明显，部分颗粒20 nm左右，大多处于40 nm左右，整体上细化效果比水冷条件差。
图4是用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定的阿魏酸哌嗪水冷工艺的颗粒粒度，测量结果表明颗粒粒径大部分集中在300 nm左右，比用电镜测量的结果要大得多，合理的解释是采用湿法测量超细阿魏酸哌嗪颗粒的粒度分布时，由于分析方法本身的局限性和超细阿魏酸哌嗪颗粒在溶剂中极易团聚等原因，所得结果与实际有一些出入，结果往往偏大。我们认为，湿法分析所得结果需要根据样品的具体情况进行讨论，在大多数情况下仍是可信和有价值的。图 4中粒径分布在亚微米区也与超细阿魏酸哌嗪颗粒的团聚有关，包含了不同大小的团聚体表现出来的团聚峰，说明阿魏酸哌嗪在纳米化后的团聚仍是一个尚未解决的问题。
图5所示，经水循环冷却的高能球磨超细阿魏酸哌嗪颗粒XRD衍射峰与原样的衍射峰峰高相比略有降低，尖锐峰也有所增宽。衍射峰增宽缘于晶粒细化效应与晶格内的应变效应。没有发现新相的产生，峰位基本没有移动。说明经水循环冷却的高能球磨超细阿魏酸哌嗪颗粒在空气气氛高能球磨过程中成分较稳定，既没有发生晶型转变和成分析出，也没有明显的氧化现象。
本品为3甲氧基4羟桂皮酸哌嗪，按干燥品计算，含C24H30N2O6 应为99.0%～101.0%，在水中微溶。经过高能球磨后的颗粒已达到纳米级，粉碎过程采用水冷循环和液氮冷却循环，以防止因粉碎过程中的升温使得原品物理性质改变。用两种粉碎工艺得到的阿魏酸哌嗪粉用四川标准92版方法作了水溶性实验，阿魏酸哌嗪超细颗粒与水溶液按10%的比例混和，经过搅拌，溶质在水中呈悬浮乳状假溶液，均匀分布于水中，经过2 h后完全沉淀;通过适当加温(50℃)，水溶性相应提高，但冷却后仍以结晶析出。
3 结论
阿魏酸哌嗪通过适当的高能球磨工艺可以获得类球形、粒度分布均匀、平均尺寸约20 nm的超细阿魏酸哌嗪颗粒。利用循环水冷和液氮循环冷却得到的超细阿魏酸哌嗪颗粒其水溶性没有明显增溶。粉碎后的阿魏酸哌嗪颗粒成分较稳定，既没有发生晶型转变和成分析出，也没有明显的氧化现象，但极易发生聚集，形成几百个纳米的团聚物。鉴于此，考虑对粉碎后的阿魏酸哌嗪纳米颗粒用可生物降解的聚乳酸为载体，制成阿魏酸哌嗪纳米微粒的包囊，一方面可以解决微粒的团聚问题，另一方面也可以将阿魏酸哌嗪纳米颗粒制成纳米微囊，用作口服剂或注射剂。虽然，阿魏酸哌嗪通过适当的高能球磨工艺可以获得类球形、粒度分布均匀、平均尺寸约20 nm的超细阿魏酸哌嗪颗粒，但其毒理学、药效学指标是否改变，其质量标准的重新确定等，均有待进一步研究。
参考文献
[1] 王宝琴.中成药质量标准与标准物质研究[M].北京:中国医药科技出版社，1994:615.
[2] 郭玉麟，钟三保.阿魏酸哌嗪的合成及其药理与临床研究[J].华西药学杂志，1987，2(1):52.
[3] YUAN Guiyan，WANG Benjie，WEI Chunmin，et al.Determination of piperazine ferulate in human plasma by HPLC and its pharmacokinetic study[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2006，15(4):238242.
[4] 张娴，彭国平.HPLC法测定活血止痛胶囊中阿魏酸的含量[J].南京中医药大学学报，2004，20(1):5859.
[5] 凌均耀，余廷龙，刘先蓉，等.阿魏酸哌嗪治疗肾小球疾病的近期疗效[J].中华肾脏病杂志，1991，7:292.
[6] 王静，张密霞，庄朋伟，等.川芎嗪、阿魏酸对心脏微血管内皮细胞白细胞黏附的影响[J].天津中医药大学学报，2007，26(3):146149.
[7] 瞿发林，谈丽娜，赵勇，等.HPLC法测定舒筋活络酒中阿魏酸的含量[J].药学与临床研究，2007，15(4):321323.
[8] 王筠，袁卓，张军平.阿魏酸对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的增殖作用[J].中医药学报，2007，35(3):47.
[9] 尤冠巧，付平，谢席胜，等.阿魏酸哌嗪对TGFβ1诱导肾成纤维细胞表型活化的影响[J].四川大学学报(医学版)，2008，39(5):736739.
[10] 王焕，付平，谢席胜，等.阿魏酸哌嗪对糖尿病大鼠肾脏的保护作用[J].中国西医结合">中西医结合肾病杂志，2008，9(7):582585，660.
[11] 贾红慧，李强华，代可一.阿魏酸哌嗪对肾炎模型动物肾功能的改善作用[J].华西药学杂志，2004，19(6):415417.
[12] 杨祥良，徐辉碧，吴继洲，等.基于纳米技术的中药基础问题研究[J].华中理工大学学报，2000，28(12):104105.
[13] 刘志生，袁钢跃，段绍斌，等.阿魏酸哌嗪治疗原发性肾病综合征的近期疗效[J].湖南医学，2000，17(2):153.doi:10.3969/j.issn.16742257.2009.04.005
【摘要】 目的 研究根据川芎的成分人工合成的阿魏酸哌嗪超细化后的特性。方法 采用搅拌式高能球磨机并以水冷和液氮冷却的方式进行研磨。结果 阿魏酸哌嗪达到20 nm左右，粉碎后成分较稳定，颗粒极易团聚，可形成乳液，其水溶性并无明显改善。结论 阿魏酸哌嗪纳米化后结构不变，无增溶现象，可将其制成纳米微囊，用作口服药或注射剂。
【关键词】 阿魏酸哌嗪; 球磨机; 纳米颗粒; 水溶性
【Abstract】 Objective To study the synthesis characteristic of piperazini ferulas superfine comminuted from the component of Ligusticum ChuanXiong.Methods High energy ballmilling machine by means of mix round was used to grind piperazini ferulas during the process of water cooling circulating and liquid nitrogen cooling.Results Piperazini ferulas was comminuted to particles about 20 nm.In XRD analysis，neither its crystallite changed，nor a new element appeared.The comminuted particles were very easy to reunite.Conclusion Watersolubility of piperazini ferulas does not change after the particles are superfinely comminuted.It might be used to made nanometersize packing capsule colloid for serving the purpose of oral administration drug and injection.
【Key words】 piperazini ferulas;ballmilling machine;nanometersize granule;watersolubility
阿魏酸哌嗪(piperazini ferulas)是根据川芎的成分人工合成的新药[1]。川芎中的阿魏酸(Ⅰ)和川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP，Ⅱ)都具有明显的活血化淤作用[24]。哌嗪(Ⅲ)的结构类似川芎嗪结构中的吡嗪，国内外治疗心脑血管疾病药物的化学结构中，许多都含有哌嗪结构部分，国内已合成阿魏酸哌嗪盐(Ⅴ)，初步的药理实验证明，它的作用比阿魏酸和川芎嗪强。阿魏酸的衍生物阿魏酸哌嗪的药理学研究表明，该药物吸收迅速，在血液中大部分以游离形式存在，易于透过生物膜，在体内转移快，不易导致蓄积。毒理学研究表明，该药毒性低，无致畸和致突作用，用于治疗脑梗死、冠心病、心绞痛、血栓闭塞性脉管炎等均有良好效果[58]，对慢性肾小球疾病、肾病综合征Ⅱ型和慢性肾功能衰竭也取得较好的近期疗效[913]。由于阿魏酸哌嗪在水中微溶，在乙醇中极微溶解，因而目前阿魏酸哌嗪都是以口服方式给药，使其在临床急救方面受到一定的限制。目前的研究结果表明，尺寸小于10 nm的超细微粒可以在血管中自由移动，根据这一特性，可以将药物制成纳米粒子注入到人体的各个部位，检查病变。又有报道，分子量小于1 000的物质，可以超细到20 nm仍保持其原有结构，而阿魏酸哌嗪的分子量是474，因此对其纳米化不影响结构，而有的物质纳米化后可以由疏水性变为亲水性。通常认为中药防病治病的物质基础来自生物活性成分或活性化学组分，因此人们的注意力主要集中在寻找具有各种生物活性的化合物。但不容忽略的是，生物机体对药物的吸收、代谢是一个复杂的过程，中药制剂产生的药理效应不能仅仅归之于药物特有的化学组成，还与该制剂的物理状态密切相关[7]。因此，改变药物制剂的物理状态是新药研制的一种有效方法。本研究探索应用物理方法使其超细化或纳米化后，在不改变其结构和药效的前提下，利用物质的纳米特性使其增溶或制成假溶液，通过快捷、低成本和安全的方式制成注射剂，从而更方便用于临床。
1 材料与方法
1.1 原料及球磨处理
采用阿魏酸为原料合成阿魏酸哌嗪盐(成都市药剂研究所提供)。以阿魏酸哌嗪颗粒细化为主要目的，采用搅拌式高能球磨机，使用玛瑙球进行研磨;为避免阿魏酸哌嗪在球磨过程中发生高温变性，球磨工艺采用低能输入的方式(300 r/min)以及外部强制冷却。具体球磨工艺分为循环水冷(20℃)和液氮强冷(-196℃)两种。
1.2 粒度分析与电镜观察
采用英国马尔文仪器有限公司生产的纳米粒度及Zeta电位分析仪(测量范围为2～3 000 nm)对原样和不同处理工艺的颗粒进行粒度分析，测定其粒度分布曲线。采用透射电子显微镜(HRTEM)观察阿魏酸哌嗪颗粒的形貌和粒度分布直观特征。均采用标准方法制样。
1.3 结晶形态分析
采用X射线粉末衍射(Philips Analytical KAlphal λ=0.15418 nm)方法分析阿魏酸哌嗪粉体高能球磨过程中可能出现的晶型转变与异质相。
1.4 水溶解性实验分析
依据四川药品92版标准行水溶解实验分析。
2 结果与讨论
图1示阿魏酸哌嗪原样透射电镜图像，图2和图3是阿魏酸哌嗪经过搅伴式高能球磨后颗粒的透射电镜照片，由颗粒形貌可以看出:原样粉末颗粒以不太规则的短杆状为主，部分颗粒的长径比约为1，呈球状，粒度基本处于亚微米级或者微米级。循环水冷条件下(图2)高能球磨颗粒基本呈球形，边界光滑，直径多处于10～20 nm，个别小于10 nm或者大于20 nm。从整体上看，粉末粒度分布范围较窄，细化效果比较好。液氮冷却条件下(图3) 高能球磨颗粒外形同水冷条件下相似，但粒度分化比较明显，部分颗粒20 nm左右，大多处于40 nm左右，整体上细化效果比水冷条件差。
图4是用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定的阿魏酸哌嗪水冷工艺的颗粒粒度，测量结果表明颗粒粒径大部分集中在300 nm左右，比用电镜测量的结果要大得多，合理的解释是采用湿法测量超细阿魏酸哌嗪颗粒的粒度分布时，由于分析方法本身的局限性和超细阿魏酸哌嗪颗粒在溶剂中极易团聚等原因，所得结果与实际有一些出入，结果往往偏大。我们认为，湿法分析所得结果需要根据样品的具体情况进行讨论，在大多数情况下仍是可信和有价值的。图 4中粒径分布在亚微米区也与超细阿魏酸哌嗪颗粒的团聚有关，包含了不同大小的团聚体表现出来的团聚峰，说明阿魏酸哌嗪在纳米化后的团聚仍是一个尚未解决的问题。
图5所示，经水循环冷却的高能球磨超细阿魏酸哌嗪颗粒XRD衍射峰与原样的衍射峰峰高相比略有降低，尖锐峰也有所增宽。衍射峰增宽缘于晶粒细化效应与晶格内的应变效应。没有发现新相的产生，峰位基本没有移动。说明经水循环冷却的高能球磨超细阿魏酸哌嗪颗粒在空气气氛高能球磨过程中成分较稳定，既没有发生晶型转变和成分析出，也没有明显的氧化现象。
本品为3甲氧基4羟桂皮酸哌嗪，按干燥品计算，含C24H30N2O6 应为99.0%～101.0%，在水中微溶。经过高能球磨后的颗粒已达到纳米级，粉碎过程采用水冷循环和液氮冷却循环，以防止因粉碎过程中的升温使得原品物理性质改变。用两种粉碎工艺得到的阿魏酸哌嗪粉用四川标准92版方法作了水溶性实验，阿魏酸哌嗪超细颗粒与水溶液按10%的比例混和，经过搅拌，溶质在水中呈悬浮乳状假溶液，均匀分布于水中，经过2 h后完全沉淀;通过适当加温(50℃)，水溶性相应提高，但冷却后仍以结晶析出。
3 结论
阿魏酸哌嗪通过适当的高能球磨工艺可以获得类球形、粒度分布均匀、平均尺寸约20 nm的超细阿魏酸哌嗪颗粒。利用循环水冷和液氮循环冷却得到的超细阿魏酸哌嗪颗粒其水溶性没有明显增溶。粉碎后的阿魏酸哌嗪颗粒成分较稳定，既没有发生晶型转变和成分析出，也没有明显的氧化现象，但极易发生聚集，形成几百个纳米的团聚物。鉴于此，考虑对粉碎后的阿魏酸哌嗪纳米颗粒用可生物降解的聚乳酸为载体，制成阿魏酸哌嗪纳米微粒的包囊，一方面可以解决微粒的团聚问题，另一方面也可以将阿魏酸哌嗪纳米颗粒制成纳米微囊，用作口服剂或注射剂。虽然，阿魏酸哌嗪通过适当的高能球磨工艺可以获得类球形、粒度分布均匀、平均尺寸约20 nm的超细阿魏酸哌嗪颗粒，但其毒理学、药效学指标是否改变，其质量标准的重新确定等，均有待进一步研究。
参考文献
[1] 王宝琴.中成药质量标准与标准物质研究[M].北京:中国医药科技出版社，1994:615.
[2] 郭玉麟，钟三保.阿魏酸哌嗪的合成及其药理与临床研究[J].华西药学杂志，1987，2(1):52.
[3] YUAN Guiyan，WANG Benjie，WEI Chunmin，et al.Determination of piperazine ferulate in human plasma by HPLC and its pharmacokinetic study[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2006，15(4):238242.
[4] 张娴，彭国平.HPLC法测定活血止痛胶囊中阿魏酸的含量[J].南京中医药大学学报，2004，20(1):5859.
[5] 凌均耀，余廷龙，刘先蓉，等.阿魏酸哌嗪治疗肾小球疾病的近期疗效[J].中华肾脏病杂志，1991，7:292.
[6] 王静，张密霞，庄朋伟，等.川芎嗪、阿魏酸对心脏微血管内皮细胞白细胞黏附的影响[J].天津中医药大学学报，2007，26(3):146149.
[7] 瞿发林，谈丽娜，赵勇，等.HPLC法测定舒筋活络酒中阿魏酸的含量[J].药学与临床研究，2007，15(4):321323.
[8] 王筠，袁卓，张军平.阿魏酸对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的增殖作用[J].中医药学报，2007，35(3):47.
[9] 尤冠巧，付平，谢席胜，等.阿魏酸哌嗪对TGFβ1诱导肾成纤维细胞表型活化的影响[J].四川大学学报(医学版)，2008，39(5):736739.
[10] 王焕，付平，谢席胜，等.阿魏酸哌嗪对糖尿病大鼠肾脏的保护作用[J].中国中西医结合肾病杂志，2008，9(7):582585，660.
[11] 贾红慧，李强华，代可一.阿魏酸哌嗪对肾炎模型动物肾功能的改善作用[J].华西药学杂志，2004，19(6):415417.
[12] 杨祥良，徐辉碧，吴继洲，等.基于纳米技术的中药基础问题研究[J].华中理工大学学报，2000，28(12):104105.
[13] 刘志生，袁钢跃，段绍斌，等.阿魏酸哌嗪治疗原发性肾病综合征的近期疗效[J].湖南医学，2000，17(2):153.doi:10.3969/j.issn.16742257.2009.04.005