牛磺酸对高糖刺激Müller细胞VEGF和TauT表达的影响

　　　　　　作者：曾凯宏， 许红霞 糜漫天

【摘要】 目的 通过检测高糖和牛磺酸培养对大鼠视网膜Müller细胞中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF) 和牛磺酸转运蛋白(taurine transporter，TauT)表达的影响，探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法 实验分6组，分别是正常对照组、牛磺酸对照组、高糖模型组、低、中、高剂量牛磺酸处理高糖组。用免疫细胞荧光双标鉴定Müller细胞，RTPCR和免疫细胞荧光双标检测Müller细胞中VEGF和TauT的表达。结果 体外25 mmol/L 高糖培养使Müller细胞VEGF mRNA及蛋白表达增加。10 mmol/L牛磺酸可有效抑制高糖诱导的VEGF上调表达(P&<0.05);高糖诱导Müller细胞中TauT表达抑制，引起TauT mRNA及蛋白表达明显下降。牛磺酸干预可上调Müller细胞中TauT的表达(P&<0.05)，提高细胞内外牛磺酸的转运能力。结论 体外高糖培养诱导Müller细胞VEGF表达增加，TauT表达下降。牛磺酸通过降低VEGF表达、提高牛磺酸转运能力达到保护视网膜的作用。该实验结果可为牛磺酸用于糖尿病早期视网膜病变的防治提供重要的实验依据

【关键词】 牛磺酸; 高糖; Müller细胞; 血管内皮细胞生长因子

　　 【Abstract】 Objective To investigate the effect of taurine on expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and taurine transporter (TauT ) in rats retinal Müller cells cultured with high glucose and observe the protection mechanism of taurine against diabetic retinopathy. Methods The cells was pided into normal control group (Control)， taurine control group (Tau )， high glucose group (HG) and high glucose plus different dosage taurine group (HG+LTau， HG+MTau and HG+HTau). The morphologia were identified by confocal microscopy. The changes of VEGF and TauT expressed in Müller cells were studied by immunofluorescence staining method in a qualitative way and RTPCR in a quantitative way. Results High glucose could significantly increase the expression of VEGF in Müller cells (P&<0.05). 10 mmol/L taurine intervention could significantly inhibite the upregulation of VEGF in Müller cells induced by high glucose (P&<0.05). Our study also suggested that the expression of TauT reduced in high glucose group and could be stimulated by taurine supplementation (P&<0.05). Conclusion Our studies reveal that taurine ameliorates diabetic retinopathy possibly via decreasing the expression of VEGF in Müller cells， increasing the ability of taurine transporter of Müller cells， which suggest a possible utility of taurine as an adjuvant therapeutic agent in the management of diabetes and its complications.【Key words】 taurine; high glucose; Müller cells; vascular endothelial growth factor

　　视网膜 Müller细胞是一种特化的神经胶质细胞，具有维持视网膜的正常结构、营养视网膜神经元、参与构成血视网膜屏障等多种生理功能，而且还参与视网膜的多种病理生理过程。各种原因导致的视网膜损伤会引起Müller细胞功能异常。常见的引起Müller细胞功能异常的因素有：视网膜缺血缺氧、视网膜机械和光损伤、免疫损伤和糖尿病视网膜病变等[1]。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)是一种特异性的血管生长调节因子，与血管的形成和增生密切相关。视网膜损伤可诱导VEGF的释放增加，这种VEGF释放增加主要是由Müller细胞分泌的。增加的VEGF通过作用于视网膜血管内皮细胞上大量高亲和力受体，促进血管内皮细胞的分裂、增殖，进而导致视网膜新生血管的生成[24]。牛磺酸是视网膜组织中含量较高的一种游离氨基酸。以往的研究表明，牛磺酸在视网膜中具有多种复杂的生物学效应。视网膜是通过血视网膜屏障来富集牛磺酸的，牛磺酸脂溶性差，通过细胞膜的速度较慢，但其在视网膜细胞内外的浓度差可达 400∶1，这是由于视网膜细胞上存在大量牛磺酸转运蛋白(taurine transporter，TauT)，所以牛磺酸能很快进入视网膜细胞，发挥其视觉保护作用。一些研究发现，在胰岛素依赖型糖尿病患者体内，血浆和血小板中牛磺酸含量均明显下降，而膳食补充牛磺酸可明显改善这种糖尿病引起的牛磺酸含量下降情况。这可能与糖尿病时患者体内牛磺酸转运能力受抑有关。本研究采用体外培养的大鼠视网膜Müller细胞高糖模型，观察高糖和牛磺酸对Müller细胞VEGF和TauT表达的影响，深入探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料出生后3～5 d的SD大鼠7只，由第三军医大学实验动物中心提供。牛磺酸：北京世纪维他生物技术有限公司，纯度&>95%;胎牛血清：兰州民海;DMEM/F12、胰酶：美国Gibco公司;Dglucose：Sigma公司;抗GS一抗：Adi公司;波纹蛋白(vimentin)：武汉博士德;TauT：Alpha Diagnostic公司;VEGF：北京博奥森公司;荧光二抗罗丹明、FITC购于北京中杉生物技术有限公司;Hoechst为北京碧云天生物公司产品;Tripure RNA抽提试剂为上海生物工程技术公司产品;逆转录及PCR试剂为Promega产品;RTPCR采用BioRad系统;激光共聚焦扫描电镜由第三军医大学西南医院中心实验室提供(Zeiss LSM 510 Metanlo，德国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 SD大鼠视网膜Müller细胞的纯化培养及鉴定 出生后3～5 d的新生SD大鼠，用750 ml/L酒精浸泡消毒同时麻醉，无菌条件下取眼球，双抗PBS漂洗数遍，小心剥离视网膜，加入5 g/L胰蛋白酶，37℃消化20～30 min，充分吹打，加入含200 ml/L血清的培养基终止消化，不锈钢网过滤，1 000 r/min离心3～5 min，培养基重悬，离心，反复2次。去上清后加入含200 ml/L血清的培养基制细胞悬液，调细胞密度为3×108个/L，接种于25 cm2培养瓶中。3 d换培养基， 9 d后，将培养瓶密封，放入恒温摇床，200 r/min摇24 h进行Müller细胞纯化。细胞形态一致后，1∶2传代分瓶，第2/3代细胞用于实验。细胞传代后接种于预置盖玻片的24孔培养板中，24 h完全伸展后进行鉴定。用Müller细胞标志物GS和vimentin联合，免疫细胞荧光双标鉴定。免疫细胞化学双染步骤为：细胞爬片以40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗5 min×3次，用含10 g/LBSA、5 ml/LTritonX100的PBS缓冲液孵育30 min，同前漂洗后，用含50～100 ml/L正常羊血清的PBS缓冲液孵育10 min，加1∶2 000稀释的AntiGS，4 ℃过夜(同时设PBS替代一抗的空白对照和正常羊血清替代一抗的替代对照)，PBS漂洗后与罗丹明标记的荧光二抗37 ℃孵育30 min，PBS漂洗后加1∶200稀释的Antivimentin，37℃，2 h，PBS漂洗后与FITC标记的荧光二抗37 ℃孵育30 min，PBS漂洗后加Hoechst于37 ℃孵育5 min， PBS缓冲液漂洗后，900 ml/L甘油封片，激光共聚焦显微镜观察照相。第3代的Müller细胞用于试验。

　　1.2.2 高糖模型建立及实验分组 待细胞达80%融合时，弃掉含血清的培养液，换无血清的培养液培养24 h后，再换成含不同浓度葡萄糖的培养液，分别为：5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L，通过12、24、36、48、72 h观察后，确立Müller细胞高糖模型的最适糖浓度为25 mmol/L.实验分6组，分别是：(1)正常对照组(普通培养基培养的细胞，不含葡萄糖和牛磺酸;Control)。(2)牛磺酸对照组(含10 mmol/L牛磺酸的培养基培养的细胞;Tau)。(3)高糖模型组(含 25 mmol/L葡萄糖的培养基培养的细胞;HG)。(4)低剂量牛磺酸处理高糖组(含0.1 mmol/L牛磺酸、25 mmol/L葡萄糖的培养基培养的细胞;HG + LTau)。(5)中剂量牛磺酸处理高糖组(含1 mmol/L牛磺酸、25 mmol/L 葡萄糖的培养基培养的细胞;HG + MTau)。(6)高剂量牛磺酸处理高糖组(含10 mmol/L牛磺酸、25 mmol/L葡萄糖的培养基培养的细胞;HG + HTau)。

　　1.2.3 RTPCR检测大鼠视网膜Müller细胞VEGF和TauT mRNA表达 用Tripure试剂提取总RNA.核酸蛋白定量仪检测RNA纯度及含量。取总RNA 3 μg，加入Oligo(dT)18 0.5 μg，加无菌水至11 μl，75 ℃水浴5 min，加5×反应缓冲液4 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、RNA酶抑制剂20 U，加水至19 μl，37 ℃水浴5 min，加MMuLV逆转录酶200 U，42 ℃反应60 min，70 ℃放置10 min制备cDNA.扩增条件为βactin FP1：TTGTAACCAACTGGGACGATATGG，RP2：GATCTTGATCTTCATGGTGCTAG，退火温度：63.5 ℃，产物长度764 bp，VEGF FP1：CAATGATGAAGCCCTGGAGTG，RP2：GTCTGCGGATCTTGGACAAAC，退火温度55.7 ℃，产物长度196 bp. TauT FP1：GCCACATACTACCTATTCCA，RP2：CAGCAGCATACAGTCCCT，退火温度62.3 ℃，产物长度550 bp.

　　1.2.4 免疫细胞荧光法检测Müller细胞VEGF和TauT蛋白表达 一抗为1∶200稀释的AntiVEGF和1∶1 000稀释的AntiTauT，其余步骤与Müller细胞鉴定相同。

　　1.3 数据的统计分析所有数据均以均数±标准差表示，用单因素方差分析分析差异有无统计学意义，采用SPSS 13.0统计软件处理结果。

　　2 结果

　　2.1 Müller细胞的原代培养及鉴定接种24 h后，细胞部分融合，成簇生长，贴壁不紧;培养3 d后，细胞贴壁紧，60%融合，形成集落，呈圆球形，部分细胞从圆球形底部伸出突触;培养6 d后，细胞大部分融合，胞体呈纤维形，核圆形或椭圆形;混养的大鼠视网膜细胞培养至第9 d时，下层细胞铺满瓶底，细胞与细胞之间相互连接，形成“毯”状，可见Müller细胞胞膜边界。上层细胞相对较分散，可见圆形或椭圆形的细胞核。振摇24 h后，上层细胞减少，培养基中含有大量细胞碎片和一些被摇下的小细胞。下层细胞分布均匀，形态基本一致，生长情况良好，可见清晰的长梭形Müller细胞，基本沿同一方向生长，排列相对规则。消化传代后30 min左右细胞开始贴壁，并且很快相互融合，细胞长至铺满瓶底后继续传代，得到3代细胞，在3代细胞中未发现小细胞，镜下可见清晰的Müller细胞，形态不规则，梭形或多角形，核相对较大，胞浆淡，胞膜边界清晰，贴壁紧。以Müller细胞特征性标识物GS和Vimentin对细胞进行鉴定，98%以上的细胞两种抗体染色呈阳性(见图1)。

　　2.2 高糖和牛磺酸对Müller细胞 VEGF mRNA表达的影响RTPCR结果显示，与正常对照组相比，25 mmol/L 高糖培养组Müller细胞中VEGF mRNA 表达量明显增加(P&<0.05)，低剂量和中剂量牛磺酸处理对高糖组Müller细胞中VEGF mRNA 表达量无明显的影响作用(P&>0.05)，高剂量牛磺酸处理可明显降低高糖组Müller细胞中VEGF mRNA 表达量(P&<0.05)。牛磺酸对照组Müller细胞中VEGF mRNA 表达量与正常对照组无显著性差异(P&>0.05)(见图2)。

　　2.3 高糖和牛磺酸对Müller细胞 TauT mRNA表达的影响RTPCR结果显示，与正常对照组相比，25 mmol/L 高糖培养组Müller细胞中TauT mRNA 表达量明显降低(P&<0.05)，不同剂量牛磺酸处理均可明显增加高糖组Müller细胞中TauT mRNA 表达量(P&<0.05)。牛磺酸对照组Müller细胞中TauT mRNA 表达量明显高于正常对照组(P&<0.05)(见图3)。

　　2.4 高糖和牛磺酸对Müller细胞 VEGF蛋白表达的影响免疫细胞荧光染色结果显示，正常对照组Müller细胞中，VEGF免疫阳性染色较弱，主要分布在胞核和胞浆中，胞膜几乎不表达VEGF;牛磺酸对照组中VEGF阳性染色相比正常对照组有所减弱，主要在胞核中表达，胞浆表达较少;与正常对照组相比，25 mmol/L 高糖培养组Müller细胞中VEGF免疫荧光强度明显增强，胞核、胞浆和胞膜均有VEGF表达，胞核和近核的胞浆中表达很强;低剂量牛磺酸处理高糖组Müller细胞中，VEGF免疫荧光强度和阳性染色分布接近25 mmol/L 高糖培养组，其荧光强度明显强于正常对照组;中剂量和高剂量牛磺酸处理可明显减弱高糖组Müller细胞中VEGF免疫荧光强度，其阳性染色主要分布在胞核和核周(见图4)。

　　2.5 高糖和牛磺酸对Müller细胞 TauT蛋白表达的影响免疫细胞荧光染色结果显示，正常对照组Müller细胞中，TauT免疫阳性染色较强，胞核、胞浆和胞膜均有表达，胞浆中靠近胞核处表达较强;牛磺酸对照组中TauT阳性染色相比正常对照组明显增强，尤其在胞浆中;与正常对照组相比，25 mmol/L 高糖培养组Müller细胞中TauT免疫荧光强度明显减弱，主要分布在胞核和核周;低剂量牛磺酸处理高糖组Müller细胞中，TauT免疫荧光强度高于25 mmol/L 高糖培养组，远核的胞浆和胞膜增强比较明显;中剂量和高剂量牛磺酸处理可明显增强高糖组Müller细胞中TauT免疫荧光强度，其阳性染色主要分布在胞核、核周和胞膜(见图4)。

　　3 讨论

　　DR是常见且严重的糖尿病眼部并发症，是四大主要致盲疾病之一。随着DM发病率不断上升，其危害性亦日趋明显。在DR的发病过程中，一个最重要的因素就是高糖。对DR的研究多采用动物模型进行体内实验研究，建立视网膜Müller细胞体外高糖模型，在体外模拟体内DM微环境，排除体内其它因素的干扰，在DM病程的特殊时期更加直接观察细胞的变化，这些是体内动物实验所不能代替的。体外培养时(25～30) mmol/L的高糖浓度，可近似地等同于糖尿病时体内高糖状态，本实验采用(5～50) mmol/L之间的不同浓度的葡萄糖培养，通过台盼蓝拒染实验及姬姆萨染色实验观察，最后确定25 mmol/L葡萄糖浓度作为模拟体内绝对的高糖状态的最适浓度。已有实验证实，糖尿病早期新生血管形成之前，就出现VEGF表达增加。而这种VEGF的增加主要是由视网膜Müller细胞分泌的，这些结果提示早期Müller细胞VEGF分泌增加可能与随后的新生血管形成密切相关。也有研究发现，非增生性糖尿病患者视网膜VEGF表达与正常非糖尿病患者无明显差异[57]。关于糖尿病引起Müller细胞分泌VEGF的机制还不清楚，有人认为是糖尿病导致的组织缺血缺氧可激活Müller细胞内编码VEGF的激活蛋白(AP)1基因，从而提高Müller细胞合成和释放VEGF。抑制或减少VEGF的表达对糖尿病的早期预防和治疗非常必要。本实验通过体外研究发现，牛磺酸干预可明显减少Müller中VEGF的表达。关于糖尿病引起视网膜牛磺酸含量降低的原因目前还不是十分清楚，可能与牛磺酸的跨细胞膜转运有关。我们知道，牛磺酸主要通过细胞内外转运调节生物体内牛磺酸“稳态”，以发挥牛磺酸的生物学效应，牛磺酸在视网膜内的转运主要是通过Na+、Cl-依赖的TauT来实现的。有人通过TauT基因敲除鼠研究发现，TauT基因敲除引起大鼠视网膜内牛磺酸浓度明显降低，进而引起视网膜变性[8]。Amira等[9]通过体外研究发现， TauT表达改变与体内牛磺酸含量以及牛磺酸摄取与释放能力密切相关。本实验通过体外研究发现，高糖培养后Müller中TauT表达明显降低，牛磺酸干预可明显增加Müller中TauT的表达。

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