【摘要】 近几年，国内外学者利用超声联合微泡造影技术所产生的生物学效应，实现了微泡造影剂携载药物和基因对肿瘤的靶向治疗。随着超声技术的广泛应用和超声造影剂的深入研究，超声联合微泡造影技术这一安全、高效、操作简单、无创的治疗手段将越发具有更大的应用潜力。本文拟就目前脂质超声微泡的特点及应用做一综述，并结合磁性纳米技术的发展，为能研制出更具临床应用价值的微泡造影剂提出一些自己的观点。
【关键词】 超声造影剂; 诊断; 治疗; 肿瘤; 文献综述
Abstract: Resently years，researchers utilize biological effects generated by microbubble contrast agent combined ultrasound techniques to implement therapy of tumor by microbubble carrying drug and gene.With the wide application of the ultrasound techniques and the deepgoing of utrasound contrast agent，methods of microbubble contrast agent combined ultrasound techniques which is safe，high performance，operation simply，and no trauma will posses great potential of application.The article overview characteristic and application of lipid ultrasound microbubble，combined the development magnetism namometer technics，author draw some standpoint in order tomanufacture microbubble contrast agent that posses great clinic value.
key words:：utrasound contrast agent ;diagnosis;therapy，;tumor
1967年Gramiak等[1]在心内注射吲哚青蓝染料后于超声心动图上观察到云絮状影，这一现象引起了他们的思索，并将此现象解释为注入此染料后在血液里所形成气泡的结果，该种小气泡有增强超声显影的功能。他们利用这种影像来观察心脏病变，由此引发了超声史上的革命，创立了早期的超声造影法，提出了超声造影剂的概念。目前关于超声造影剂的研究已有30余年的历史，经国内外大量学者的研究已经产生了多种包膜微泡造影剂，它可显著增强实质器官的灰阶显像，是很好的声学对比剂。大量研究表明，超声造影剂不仅仅可以提高图像的分辨率和对比度，其在体内亦可作为安全性和有效性高的携带药物和基因的载体，在超声作用下能显著提高靶部位药物的传输效率而减少全身毒副作用，明显提高局部细胞和组织的基因转染和表达。随着超声造影剂与超声造影设备的迅速发展，使得超声造影成为当前超声医学的热门研究课题。
1 超声造影剂的发展简史
超声微泡造影剂是由气体构成的核心和由蛋白质、脂质、糖类等物质构成的外壳两部分组成，从造影剂的概念出现至今，其发展历经了3个阶段。第1阶段是不稳定的无成膜物质的气体，如Albunex、Levovist等，其不能通过外周静脉注射，而只能经心导管注入主动脉和心腔内。又由于其不能通过肺循环且在血液里持续时间短而使它的应用受到限制，仅用于右心显影。第2代造影剂是有蛋白质和多糖类膜结构的空气微泡造影剂，如PESDA、Option等，由于这类造影剂的直径已经可以使其通过肺循环并且能长期存在于血液循环当中，从而也可以使左心和外周血管显影，实现了超声造影由有创向无创的飞跃。第3阶段的造影剂在膜材料和核心气体上都致力于选择更考究的物质上，形成了以氟碳气体为核心，抗压性和稳定性高的多聚化合物和脂类为外壳的微泡造影剂，如Aerosome等。
2 超声微泡造影剂的成像技术及其在肿瘤诊断方面的应用
超声造影剂的特异性成像技术主要是利用声波对气体反射比液体大近1 000倍的原理及微泡的非线性声学效应，通过声衰减、声速的改变和增强后散射等方式改变声波与组织间的吸收、反射和折射等相互作用，使超声回声增强，从而提高灰阶成像的对比分辨率和空间分辨率，达到有利于诊断疾病的目的。这些成像技术[2]有单双相脉冲反相成像技术、能量多普勒成像技术、二次谐波成像技术、间歇性触发成像技术、实时超声造影成像技术和分子成像技术。有报道提出了成像特异性序列的多脉冲成像技术，它利用脉冲相和振幅改变相结合的方法使组织回波减小而使造影剂回波增大。
超声造影技术可以提高超声多普勒对血流信号的敏感性，使组织和血流的声像图质量大加改善，提高肿瘤的分辨率，对肿瘤良恶性的鉴别诊断有很大帮助。肝脏肿瘤的超声造影增强特征取决于该肿瘤的供血特征和血流灌注特征，也是其对病变性质诊断的重要依据。肝细胞癌以肝动脉供血为主，血流速度较快，在动脉期病灶迅速增强，表现为快进快出[3]。肝转移癌受原发癌病理学类型及血供的影响，其增强表现也各不相同，可环状强化也可快速团状灌注强化，但多在门脉期增强影像立即消退，其影像低于肝实质。肝血管瘤是由血窦构成的良性肿瘤，因血流速度缓慢致造影剂进出缓慢，表现为从边缘向中心的逐渐增强，典型的血管瘤在肝实质相时其增强影像高于周边肝实质。最近，Willmann等[4]制作了定位于血管内皮生长因子受体和αⅤβ3整合素的双靶点靶向微泡，并在荷人卵巢癌的小鼠上进行B超显影，证明双靶点的靶向微泡能更多地聚集于靶肿瘤，达到更理想的肿瘤显影效果。
3 超声造影剂的生物学效应——超声空化效应和声孔效应
超声空化分稳态空化和瞬态空化两种。在低声压下，每个随平衡半径振动的微泡都会在其附近产生微束，此微束能在周围产生切变力，致使气泡变形破裂，此即稳态空化。随声强的增大，空化核将随着超声周期相而膨胀、收缩以及爆破。微泡的膨胀和压缩可导致非线性信号的产生，在最后瞬间内爆阶段将泡内聚集的能量释放出来并伴随强大冲击波、高速微射流和自由基的产生，此为瞬态空化。这些物理条件和化学基团的形成增加了组织细胞的损伤，使临近组织的毛细血管通透性和细胞膜通透性增高。Miller 等[5] 指出微泡可视为一种人为的空化核，它增加了血液里空化核的密度，从而降低了超声波的空化阈值，在一定声强的超声波作用下发生瞬态空化效应而引起一定的生物学反应。声孔效应是由空化效应所引起的细胞膜通透性的增加，亦即声空化。空化效应产生的冲击波可使临近细胞膜被击穿，形成可逆性和不可逆性两种小孔。国内冉海涛等[6]体外培养大鼠肺动脉血管平滑肌细胞，加入造影剂后用超声辐照20 s，电镜观察证实平滑肌细胞及细胞膜的形态结构可见明显异常改变，细胞膜表面可见大小不等、数量不一的小孔，呈弹坑样或火山口样，实验结束后继续培养24 h则小孔样结构消失，证明出现的小孔是可逆的。有报道[7]指出，过度的声孔效应也将对DNA和细胞产生一定的损伤，所以在微泡携载基因治疗时要控制好照射剂量(超声强度、辐照时间)和微泡浓度。Koch等[8]使用频率为2 MHz、照射强度0.5 W·cm-2的超声波分别照射3组鼠的神经胶质瘤，各组分别辐照30、60、90s，同时加入阳离子脂质体进行基因转染。结果发现，照射60s组的基因转染率明显增加且不损伤细胞，而照射90s组的肿瘤细胞几乎全部被杀死。当加入微泡造影剂之后，空化效应使肿瘤细胞基因转染率明显提高，当造影剂浓度达到200 mg·ml-1时，肿瘤细胞就会被严重破坏。Ward等[9]观察了不同浓度微泡造影剂对淋巴细胞悬浮液的空化效应，发现微泡的浓度越高，淋巴细胞的损伤越大，说明超声波声孔效应不仅使细胞膜通透性增加，而且在微泡存在的情况下，随着微泡浓度的增高，淋巴细胞的损伤增大。超声破坏微泡所产生的生物及机械学效应对人体也将具有一定的副作用，有相关报道[10]表明，超声破坏微泡可引起组织出血、血管内溶血、含气组织与器官的损伤。
4 超声造影剂在介导药物或基因治疗肿瘤方面的作用机理和应用
随着分子生物学和超声影像技术研究的不断深入，最近研究[11]发现，超声微泡造影剂作为一种新型的药物或基因载体，不仅可以增强超声显像，还具有靶向治疗作用。利用微泡在超声照射下的空化效应，可以将药物或治疗基因递送到受超声辐照的特定细胞或组织中，减少了全身用药的毒副作用，明显提高了基因转染的效率。
利用超声波联合微泡造影剂所产生的空化效应，并通过改变超声仪器参数可实现在特定组织靶向释放药物，对药物释放进行实时监控，提高肿瘤局部化疗药物浓度，减少药物用量，达到增强药物疗效和减少全身毒副作用的目的。药物与微泡的结合方式有:(1)直接与气体被包裹入微泡内部;(2)与微泡以静电吸附的非共价方式结合在一起;(3)带负电的药物直接黏附在带正电脂质的表面;(4)药物被包裹在脂质双分子层中;(5)疏水性药物可先与油脂混合形成膜状物后再包裹入微泡内部。超声微泡联合超声技术介导基因和药物靶向治疗正是利用了超声空化效应，将载有药物或基因的微泡载体经外周静脉或局部注入体内，待其到达靶区后用超声照射而使靶区产生空化效应，微泡内爆后将药物和基因释放入靶区。所释放的药物和基因可通过扩大的毛细血管内皮细胞进入组织间隙，最后经由细胞膜上的小孔汇集在细胞内，增强了外源基因的摄取、转染与表达，提高了药物的局部浓度，实现了靶向治疗作用。Lawrie 等[12]的研究表明，超声辐照可使裸露DNA 对血管内皮细胞的转染率提高10 倍，倘若再联合使用微泡造影剂又可再提高300 倍，这表明联合使用超声和微泡造影剂可使血管内皮细胞对裸露DNA 的转染率提高3000倍。国内已有文献[13]报道超声引导下瘤体内注射超声造影剂和p53 基因后用超声照射，既可有效地控制肝癌基因治疗的靶向性，又能提高外源性基因的表达量。Unger等[14]用自制的负荷紫杉醇药物的脂质体微泡进行动物实验，结果表明，与对照组相比，紫杉醇的药效大大增强。Hayashida 等[15] 将无水酒精混合在常用于肝脏显像的CO2 微泡中，经皮穿刺治疗后发现只需1次就可使直径小于3 cm 的肿瘤坏死，并且注射的无水酒精量也大大减少，无严重并发症发生，治疗后无肝内及腹膜转移。Aoi等[16]以超声微泡为载体，将单纯疱疹胸腺激酶基因成功导入肿瘤细胞中，证明超声微泡作为一种新的基因递送方法用于肿瘤的基因治疗具有相当广泛的应用前景。近来国内实验研究[17]发现，微泡造影剂联合超声技术可引起肿瘤新生血管内皮细胞的损伤，胞内线粒体肿胀、变性。
近年来，国外有学者在磁性超声微泡造影剂的制备上有一些初步研究，但在其与超声联合作用下对肿瘤治疗方面的研究甚少，这引起了笔者的关注和思考，与普通脂质造影剂相比，其不同之处在于磁性微泡对肿瘤进行药物或基因治疗的同时还可进行热疗，产生此作用有赖于磁性纳米材料的诸多特性。磁性纳米材料因既具有纳米粒子的比表面积大、粒径小的特性，又具有磁响应性和超顺磁性而被广泛应用于医学生物学领域，尤其是在生物学检测诊断、药物治疗和肿瘤热疗等方面有了长足发展。磁性载药控释系统在药学中被称为磁控导弹，由于其简单易得，效果明显，所以具有广阔的应用前景。它作为药物载体可以药物包埋于粒子骨架中和直接吸附于粒子表面两种方式与药物结合，这两种结合方式可以达到慢释和快释的不同效果——当将其注入机体后，由于它的磁响应性，在外加恒定磁场的作用下向靶部位定向定位移动，这就是其肿瘤靶向治疗的基础。Guo等[18] 采用改进的方法合成了集荧光示踪、靶向给药和温度响应于一体的多功能性微球，磁性脂质体则是将磁性纳米粒子包裹入脂质体内部而形成的。东南大学基础医学院张东生教授等人以锰锌铁氧体为载体，将其和药物包裹在脂质体内自行制备了含砷磁性脂质体，将该磁性脂质体置于交变磁场中处理浆液性卵巢癌，结果证实该纳米磁性脂质体在交变磁场下升温、控温，以致发挥热化疗的双重作用，抑制卵巢癌细胞的生长并促使其凋亡。磁靶向给药系统已是近几年研究的热点，四川大学的张景对研制抗癌药物的磁性泡囊的可行性进行了探讨并对其质量进行了评价。
5 存在问题与前景展望
超声造影剂和磁靶向给药系统对疾病的治疗功效在医学界引起了学者们的广泛关注，对其研究也在不断深入，但将二者结合后对肿瘤治疗方面的深入研究国内外仍少有详细报道，如果将磁性材料与超声脂质微泡相融合形成超声磁性脂质微泡，集两者优势于一体，在增强肿瘤影像的同时既能发挥靶向热化疗、基因治疗的功效，又可对肿瘤进行体外示踪，这将不失为超声造影领域又一创举。笔者认为，随着纳米技术的发展、超声医学与药学的进步，更多的研究者将致力于开发出此类新型超声造影剂，它作为一种无创性治疗手段，相信会在肿瘤的治疗方面具有极大的研究价值和应用潜力，会为肿瘤的治疗带来新希望，也必将有其广阔的发展前景。
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