作者：林海燕 熊成容 朱琴 吴丹丹 唐飞 周颖
【摘要】 目的 ：探讨丹参注射液对冻融小鼠卵巢同种异体移植缺血低氧损伤的保护作用及可能机制。方法：收集B6C2F1第1天新生(D1)小鼠卵巢，慢冻速融后移植至B6C2F1代8～12周雄鼠的肾被膜下，移植后小鼠按给药不同分为对照组和丹参组，分别于移植后1 d（24 h）、2 d(48 h)和14 d回收移植物，进行超氧化物歧化酶（SOD）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的RT-PCR半定量测定，同时移植后14 d回收移植物做HE染色全卵巢卵泡计数及PCNA免疫组化分析。结果：移植后各时间段卵巢组织SOD mRNA的表达，丹参组均高于对照组，而iNOS mRNA的表达则均低于对照组。移植后14 d回收全卵巢总卵泡数，丹参组（2 709±234）多于对照组（1 889±202），P＜0.05；卵泡存活率，丹参组（64.1%）显著高于对照组（44.7%），P＜0.05。结论 ：丹参注射液可能通过上调SOD mRNA的表达，抑制iNOS mRNA的表达而改善冻融小鼠卵巢同种异体移植缺血低氧性损伤，从而提高卵泡的存活率。
【关键词】 丹参；卵巢；冷冻保存；移植
Abstract: Objective: To explore the protective effects of danshen injection on ischemia injury in heterotopically grafted newborn mouse ovaries. Methods:Ovaries from B6C2F1 newborn mice were cryopreservation and the thawed ovaries were transplantated into kidney capsules of 8～12 w adult male mice.The mice were pided into two groups:control group and danshen group.The recipient mice were sacrificed on 1 d，2 d and 14 d respectively after transplantation. The grafts from 1 d， 2 d and 14 d were removed to assess the mRNA expressions of SOD and iNOS with RT-PCR. Meanwhile，the grafts from 14 d were processed histologically for follicle counting and immunohistochemically for PCNA. Results: SOD-mRNA expression of ovarian tissue in the duration period after transplantation were higher than that of danshen group， and the iNOS-mRNA expression were lower than that of control group. Number of follicles in 2 week old grafts after transplan-tation of danshen group （2 709±234） was more than that of control group （1 889±202）.There was an significant improvement in survival rate from 44.7% to 64.1% if host animals were to be administered with danshen injection. Conclusion: Danshen injection may improved the survival rate of ovaries by reducing ischeamia injury in heterotopically grafted newborn mouse ovaries with the increase of SOD-mRNA expression and the decrease of iNOS-mRNA expression.
Key words: danshen；ovary；cryopreservation；transplantation
半个世纪以来的研究表明，卵巢组织的冷冻保存和卵巢移植是目前保留癌症患者生育能力的较好方法[1]。移植后缺血低氧损伤导致的大量卵泡丢失仍然是阻碍移植卵巢组织功能恢复的关键问题[2]，其机制可能是移植物中脂质过氧化和其他氧自由基所造成的缺血低氧损伤[3]。丹参是一种常用的活血化瘀中药，它能清除自由基、改善血流变化和微循环状态。许多研究表明，丹参对心、肝、肺等多种组织器官的缺血损伤具有明显的改善作用，但对于冻融卵巢组织移植过程中缺血低氧导致卵泡损伤的保护作用尚未见报道。本实验观察丹参注射液对冻融小鼠卵巢移植早期缺血低氧卵泡损伤的保护作用及相关基因超氧化物歧化酶（SOD）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达影响，探讨丹参的外源性保护作用及其与移植物低氧相关基因表达之间的关系。为进一步探讨如何降低冻融卵巢组织移植早期缺血低氧损伤机制提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 实验动物为C57BL/6j雌鼠和BALB/c雄鼠，小鼠购自中国科学院国家啮齿动物研究中心上海分中心上海斯莱克斯有限公司。供体为8～10周龄C57BL/6j雌鼠和10～12周龄BALB/c雄鼠杂交的F1代第1天小鼠卵巢，受体为F1代8～12周雄鼠。
1.2 主要试剂与设备 丹参注射液（正大青春宝药业有限公司生产，批号Z33020177）；Leibovitz-15、胎牛血清、DMSO（Sigma公司）；兔抗增殖细胞核抗原（PCNA）多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司 ）；反转录试剂盒（TAKARA）；KRYO10-22seriesⅢ程序冷冻仪(英国Planer公司)；ThemoHybaid PCR仪(英国TECHNE公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 卵巢的收集，低温保存和解冻：断颈处死1日龄受体雌鼠，体视显微镜下分离卵巢，放入L15液中，去掉卵巢周围的包膜，卵巢转移至冷冻液（L-15、10% FBS和1.5 mol/L DMSO)中，再把10～12枚卵巢转移至0.25 mL的塑料麦管中，并用聚乙烯氯化物粉末密封细管。采用Gosden的慢冻方法进行冷冻，最后投入液氮保存。卵巢移植时把冷冻保存1周至6个月的卵巢麦管从液氮中取出，在空气中放置20 s，然后快速投到室温水中10～20 s，取出卵巢转移至L15(含10% FBS)液中。在L15液(含10% FBS)中多次漂洗以去除其中的抗冻剂。
1.3.2 卵巢移植：8～12周龄的雄鼠作为受体，麻醉后背部切开显露双侧肾脏，用锐利镊在肾囊上撕开一个洞，把解冻的卵巢塞入到肾囊中，每侧一个。
1.3.3 实验分组与移植卵巢回收：将受体小鼠按给药不同分为两组：对照组和丹参组，各40只，分别于移植前1 d至回收当日每天腹腔注射0.5 mL生理盐水和0.5 mL(含0.15 g)丹参注射液。于移植后1 d、2 d和14 d三时间段回收。各时间段小鼠卵巢放入RNA-latter液中用于SOD mRNA及iNOS mRNA的RT-PCR半定量测定，同时移植后14 d回收移植物固定、石蜡包埋用来做HE染色及PCNA免疫组化分析。实验中另取移植后14 d大B6C2F1雌性小鼠新鲜卵巢10个固定包埋作为卵巢卵泡计数的新鲜组。
1.4 观察指标与方法
1.4.1 组织学检查和全卵巢卵泡计数：移植后14 d回收和14 d新鲜卵巢，在Bouin’s液中固定过夜，石蜡包埋后5μm连续切片进行HE染色，高倍镜（×400）下进行卵泡计数。卵泡分类如下：①单层扁平颗粒细胞围绕卵母细胞的为原始卵泡。②单层立方颗粒细胞围绕卵母细胞的为初级卵泡。③两层或以上立方颗粒细胞围绕卵母细胞，无窦腔的为次级卵泡。④两层以上颗粒细胞，卵泡内有窦腔形成为窦卵泡。为避免卵泡重复计数，只计数有卵母细胞核的卵泡。各组卵泡总数与新鲜组卵巢卵泡总数的比为卵泡存活率。
1.4.2 PCNA免疫组化分析：移植后14 d回收的卵巢组织常规固定包埋，5μm连续切片每隔10张切片取一张按试剂盒说明进行免疫组化染色，苏木素复染。结果判断：阳性呈棕褐色定位于细胞核内，阴性细胞核呈蓝色。每张切片在200倍视野下计数5个视野，每个视野计数200个以上细胞中染色阳性的细胞数，计算阳性指数（阳性指数%=视野内的阳性细胞数/视野内总细胞数×100%）。
1.4.3 RT-PCR检测SOD mRNA、iNOS mRNA表达：用Trizol一步法提取总RNA。M-MuLV逆转录酶及Oligo(dT)18 primer 逆转录成单链cDNA。测定SOD mRNA、iNOS mRNA以及actin mRNA含量，引物见表1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，通过凝胶扫描和Quantity One电泳成像分析软件进行条带分析，将目的基因与内参β-actin mRNA条带的比值作为目的基因mRNA水平的参数。
1.5 统计学处理方法 卵泡计数的比较采用单因素方差分析，两组间SOD mRNA和iNOS mRNA基因表达采用两样本的t检验分析。
2 结果
2.1 全卵巢卵泡计数 移植后14 d新鲜卵巢组(见图1a)中原始卵泡成簇排列，明显多于对照组（见图1b）和丹参组（见图1c）。移植后14 d回收全卵巢卵泡计数丹参组多于对照组，且原始卵泡、初级卵泡、窦前卵泡及窦卵泡各级卵泡数均多于对照组，差异存在显著性（P &<0.05）。卵泡存活率丹参组（64.1%）显著高于对照组（44.7%），两移植组均比移植后14 d新鲜组卵泡数显著减少。详见表2。
2.2 PCNA免疫组化结果 阳性呈棕褐色，定位于初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞和卵细胞核内，阴性细胞核呈蓝色。对照组阳性率为85%～90%，丹参组为80%～85%，两组差异无显著性。见图2。
2.3 SOD mRNA和iNOS mRNA的基因表达 SOD mRNA的表达在移植后的三个时间段，丹参组均明显高于对照组（P&<0.01），卵巢移植后的各时间段均有iNOS mRNA的表达，在对照组中，第1天iNOS mRNA开始升高，第2天达到最高值，第14天有所下降，与对照组相比，丹参组的iNOS表达降低，两组差异存在显著性（P&<0.05），见表3、图3。
3 讨论
本实验结果显示，冻融新生小鼠卵巢异体移植能存活，且原始卵泡能生长发育至各级卵泡。 PCNA 又称周期素，与细胞增殖和DNA合成有关。本实验PCNA阳性表达与Oktay等[4]研究结果相一致，见于初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡的颗粒细胞及初级卵泡的卵母细胞，原始卵泡未见PCNA的表达。两组移植后14 d的卵巢组织PCNA的阳性表达均较高，说明移植的卵巢组织均处于良好的生长发育状态，但移植后14 d回收的两组移植卵巢总卵泡数明显少于移植后14 d新鲜小鼠卵巢的总卵泡数，进一步证实了卵巢组织移植过程中由于无直接血管吻合导致的缺血低氧会损失很大一部分的卵泡[4-5]。本实验中我们把冻融小鼠卵巢移植至受体小鼠具有丰富血管的肾被膜下，但移植卵巢需要在其周围重新形成血管网才能恢复血供，在移植后至血管形成期间卵巢组织由于缺血低氧将导致卵泡的大量丢失，其机制可能与活性氧ROS的释放有关[3]。许多领域的研究已经证实ROS清除剂（如SOD、抗氧化剂维生素C、维生素E等）可以抑制ROS介导的细胞凋亡。丹参中所含主要活性成分丹参酚等酚类，具有很强的抗氧化活性，可作为天然的抗氧化剂，因此我们将其应用于实验中。本实验的结果显示丹参组移植后14 d回收卵巢总卵泡数多于对照组，各级卵泡数也存在明显差异，且丹参组的卵泡存活率达64.1%，显著高于对照组的卵泡存活率的44.7%，说明丹参能减轻冻融卵巢移植后的缺血低氧损伤，提高卵泡存活率。
SOD是一类金属酶，广泛存在于不需氧的生物组织中， 它能催化超氧自由基发生歧化反应，生成过氧化氢和氧，保护细胞免受损伤。SOD活力的高低间接反映了机体消除氧自由基的能力。丹参是一种强抗氧化剂，它的保护作用可能是抑制自由基介导的细胞损害作用，保护细胞膜结构和功能的完整性。王宇等[6]在大鼠肝的冷冻灌注保存液中加入丹参注射液，然后进行大鼠原位肝移植，发现丹参组肝组织中的SOD活性明显升高，肝组织缺血再灌注程度减轻。本实验结果亦显示丹参组各时间段移植卵巢组织中的SOD mRNA的表达均显著高于对照组，说明了丹参注射液可能通过增高移植卵巢组织中SOD活性，清除氧自由基，对防治冻融卵巢移植后的缺血低氧损伤起到积极的作用。
NO和NOS与缺血再灌注损伤的关系密切。NO是一种半衰期很短的自由基气体，低浓度的NO对组织具有保护作用，而高浓度状态下对组织有损害作用。NO是由NOS催化生成的，NOS分为三型：nNOS（神经型）、eNOS（内皮型）和iNOS（诱导型），前两者的激活均依赖于钙离子和钙调蛋白的作用；iNOS在基态下不表达，可由炎症因子、内毒素等诱导激活，作用时间长，可催化生成大量NO[7]。Matsumi等发现，大多数不成熟的大鼠卵泡颗粒细胞中存在iNOS。聂莹雪等[8]实验结果显示，iNOS在缺血l2 h时开始增加， 随着缺血时间的延长其表达也逐渐增加。张莹等[9]将丹参注射液注射至重症胰腺炎大鼠模型体内来观察iNOS基因的表达，结果发现丹参早期治疗能抑制iNOS表达从而起到保护胰腺的作用。本实验中也发现在卵巢移植后的各时间段均有iNOS mRNA的表达，在对照组中，第1天 iNOS开始升高，第2天达到最高值，第14天有所下降，说明iNOS参与了卵巢移植后缺血损伤的过程。与对照组相比，丹参组的iNOS表达降低，两组差异存在显著性，提示丹参注射液可能通过下调iNOS mRNA的表达从而抑制NO的过度产生，对卵巢移植后的缺血-再灌注损伤起保护作用。
综上所述，冻融新生小鼠卵巢同种异体移植原始卵泡能存活并生长发育至各级卵泡，但移植早期的缺血低氧造成大量卵泡的丢失。丹参可能通过上调SOD mRNA的表达，清除氧自由基，下调iNOS mRNA的表达，抑制NO过度产生而对卵巢移植后的缺血低氧损伤起保护作用，从而提高卵巢移植后的卵泡存活率。
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