作者：布立敬，苏世振，李红智，林蓓蓓，张英俊
【摘要】 目的：检测乳腺癌雌激素受体α(estrogen receptorα， ERα)基因启动子区CpG岛甲基化状态，探讨乳腺癌ERα启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系。方法 ：采用免疫组化EnVisionTM二步法检测20例正常乳腺组织、44例乳腺癌组织ERα基因的表达，同时运用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)及测序法分别检测ERα基因启动子A区和B区CpG岛的甲基化状态。结果：32例ERα阳性乳腺癌组织中，ERα启动子A区、B区甲基化率分别为28.2%和18.8%。12例ERα阴性乳腺癌组织中，ERα启动子A区、B区甲基化率分别为66.7%和58.3%。ERα阳性乳腺癌组、ERα阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率均较正常组显著增高(P &<0.05)；ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组均显著增高(P &<0.05)。乳腺癌组织ERα表达与启动子区甲基化之间呈显著负相关。结论：乳腺癌组织ERα基因表达沉默与其启动子A区、B区CpG岛甲基化相关，后者有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。
【关键词】 乳腺肿瘤；雌激素受体；DNA甲基化；CpG岛；甲基化特异性PCR
Abstract: Objective: To detect the methylation of CpG island in estrogen receptor alpha (ERα) gene promotor in breast cancer， and study the relationship among ERα gene promotor methylation，ERα expression，and the clinicopathological characteristics in breast cancer. Methods: The EnVisionTM two-step immunohistochemistry method was used to detect ERα gene expression in 20 cases of normal breast tissues and 44 cases of breast cancer tissues. The methylation of CpG island in ERα gene promotor region A and B was respectively detected using methylation-specific PCR (MSP) and sequencing. Results: In 32 cases of ERα positive breast cancer tissues， the methylation rates of ERα promotor region A and B were 28.2% and 18.8%，respectively; while in 12 cases of ERα negative breast cancer tissues， the methylation rates of ERα promotor region A and B were 66.7% and 58.3%，respectively. The methylation rates of ERα promotor region A and B in ERα negative breast cancer tissues， ERα positive breast cancer tissues and breast cancer tissues were significantly higher than that in normal breast tissues (P &<0.05). The methylation rates of ERα negative breast cancer tissues were significantly higher than that of ERα positive cases (P &<0.05). A negative relationship was indicated between ERα expression and the promotor methylation in breast cancer. Conclusion: The silencing of ERα gene expression is suggested to be significantly related with the methylation of CpG island in the ERα promotor region in breast cancer. The methylation of CpG island may become the molecular marker indicating bad prognosis of breast cancer.
Key words: breast tumor；estrogen receptor；DNA methylation；CpG island；MSP
雌激素活体（estroqen receptor，ER）是抗雌激素类药物内分泌治疗的靶点，也是预后的重要指标[1-4]。ER阴性或表达下调是内分泌治疗失败及预后不良的因素。约1/4乳腺癌组织无ER表达，并且原先ER阳性的乳腺癌患者在肿瘤进程中有1/3转为ER阴性[5]。有文献报道，ER阴性与基因的变异（如插入、缺失、重组或点突变等）未发现有明确的联系，而DNA甲基化是其表达失活的主要原因之一[6]。研究显示，启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，可以作为一种有前景的肿瘤分子标志物。本研究运用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)分别检测正常乳腺组织、乳腺癌组织ERα基因启动子区CpG岛的甲基化状态，分析乳腺癌ERα启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系，进一步探讨ERα启动子甲基化作为乳腺癌临床诊断和治疗的分子标志物的可能性，为肿瘤去甲基化治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 标本来源 由温州医学院附属第一医院病理科提供新鲜组织标本。包括20例正常乳腺组织和44例乳腺癌组织。病理组织学分型(WHO标准)：浸润性癌33例，浸润性小叶癌伴浸润性导管癌1例，黏液腺癌3例，导管内癌5例，髓样癌2例。患者均为女性。年龄27～78岁，平均(48.7±8.9)岁。
1.2 免疫组化EnVisionTM二步法 抗ERα抗体和通用型二步法检测试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。染色操作按照试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗为空白对照。以试剂盒中提供的已知阳性片为阳性对照。ER阳性物质(棕黄色)位于胞核。每张切片随机选择10个高倍视野，每个视野随机观察100个细胞，计算其中阳性细胞比例(阳性细胞按染色棕褐、棕黄、浅黄分别乘以系数1、2/3、1/3来计算数目)。ER阳性细胞比例≥10%计作阳性。
1.3 DNA提取 新鲜组织标本，经蛋白酶K消化，酚、氯仿、异戊醇法提取DNA，并测定DNA浓度和含量。
1.4 DNA亚硫酸氢盐修饰 加热变性，NaHSO3修饰，透析除盐，沉淀，溶解等操作方法参见文献[7]。DNA经亚硫酸氢盐修饰后，CpG岛中的非甲基化胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，经PCR 扩增后转变为胸腺嘧啶(T)；而CpG岛中的甲基化胞嘧啶(mC)仍保留为胞嘧啶。CpG岛以外序列中的胞嘧啶(C)均转变为尿嘧啶(U)，经PCR扩增后均为胸腺嘧啶(T)。
1.5 PCR扩增ERα基因
1.5.1 引物、主要试剂和仪器：ERα基因序列号为NM_000125。各个引物序列详见
参考文献
[8]。均由上海生物工程公司合成。野生型引物W扩增未修饰的启动子区。非甲基化引物U、甲基化引物M分别扩增经修饰后的非甲基化和甲基化启动子区。Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司，PxZ型PCR扩增仪为Thermo Hybaid公司产品，BioSens SC 620型紫外凝胶分析系统为上海山富科学仪器有限公司产品。1.5.2 PCR反应体系、反应程序及结果观察：50μL的反应体系含MgCl2 2.0 mmol/L、正向引物和反向引物0.8μmol/L、四种dNTP每种终浓度0.4 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板1μg。反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火(温度、时间详见
参考文献
[8])，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 8 min延伸。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶分析系统观察拍照。1.6 PCR产物直接测序 提供启动子A、B区非甲基化引物和甲基化引物的PCR产物，由大连宝生物技术有限公司纯化和直接测序。
1.7 统计学处理方法 率的比较采用x2检验，根据x2值计算Pearson列联系数。
2 结果
2.1 ERα蛋白表达情况 正常乳腺组织ERα阳性表达率为100.0%(20例/20例)。乳腺癌ERα表达的免疫组化结果见图1，ERα阳性表达率为72.7%(32例/44例)。乳腺癌较正常乳腺组织的ERα蛋白表达显著降低(P &<0.05)（见表1）。
2.2 ERα基因启动子区甲基化情况 野生型引物(W)、非甲基化引物(U)和甲基化引物(M)的PCR扩增结果见图2。未修饰DNA的野生型引物(W)的PCR扩增结果，20例正常乳腺组织和44例乳腺癌组织均有扩增产物出现。正常组织、乳腺癌组织ERα启动子A、B区甲基化率(%)见表1。
随机各挑选一个修饰后DNA的A区和B区甲基化引物扩增产物，进行正向和反向直接测序。正向测序结果的后段和反向测序结果的后段（实际前段）除个别位点外均和预期序列一致，如A区甲基化引物扩增产物正向测序结果49、63位与预期序列不一致，但这两个位点的反向测序结果与预期序列一致。综合正反双向测序结果与预期甲基化序列完全一致。正向测序结果中，CpG岛处所有胞嘧啶C保留不变，CpG岛以外的所有胞嘧啶C均已转变为胸腺嘧啶T。反向测序结果中，CpG岛处对应的鸟嘌呤G保留不变，CpG岛以外的所有鸟嘌呤G均已转变为腺嘌呤A。
2.3 乳腺癌ERα基因启动子A、B区甲基化与ERα蛋白表达的关系 ERα阳性乳腺癌组、ERα阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率均较正常组的显著增加(P &<0.01，见表1)；ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组均显著增加(P &<0.05，见表1)，乳腺癌组织ERα表达与启动子甲基化之间呈显著负相关（A区Pearson列联系数C值CA为0.6362，B区为CB 0.5870）。合并ERα启动子A、B区甲基化的实验结果，A、B区共同甲基化的乳腺癌组、A区或B区单独甲基化的乳腺癌组的ER表达率均较A、B区均未甲基化的乳腺癌组显著偏低(P &<0.05)。
2.4 乳腺癌ERα基因启动子A、B区甲基化与临床病理因素的关系 乳腺肿瘤大小与ERα启动子A、B区甲基化无显著相关性(P &>0.05，见表1)。淋巴结转移与ER启动子A、B区甲基化亦无显著相关性(P &>0.05，见表1)。
3 讨论
DNA甲基化作为表观遗传学的一种调控机制是最早被人们发现的，它与肿瘤的发生有着密切关系。在肿瘤细胞中，异常甲基化最大的特点是全基因组的低甲基化和局部性(CpG岛)高甲基化并存[9]。最重要的甲基化碱基是胞嘧啶，通常发生在启动子区CpG岛区域。研究发现CpG岛甲基化可以抑制启动子序列的基因表达。
乳腺癌是雌激素依赖性肿瘤，其发生发展与雌激素受体ER的表达密切相关。ER α阴性乳腺癌与ERα阳性乳腺癌相比，恶性度更高，内分泌治疗不敏感，术后易复发和转移，预后较差，目前尚无有效治疗策略。乳腺癌患者ER α基因的沉默表达往往是肿瘤向恶性转化的标志。临床上ER和PR均为阳性的乳腺癌用内分泌方法治疗，其有效率高达70%～80%。ER和PR均为阴性的乳腺癌用内分泌方法治疗，其有效率不足10%，已完全脱离激素的调控[1]。研究显示原先ER阳性的乳腺癌患者在肿瘤进程中有1/3转为ER阴性，原因是由于1/3的ER阳性乳腺癌表现出ER基因CpG岛广泛的甲基化[10]。基因表达异常的原因很多，除了基因点突变外，还有基因缺失、重组及重排，但这些机制在乳腺癌细胞表达失活中的作用报道很少。提示其沉默表达与表观遗传学改变，即启动子区CpG岛的甲基化有关。现已证实ERα基因含有A、B、C三个启动子区，分别独立或协同调控ERα基因转录[11]。在乳腺癌组织中，启动子A、B区起主导作用。
MS-PCR方法是由Herman等[12]于1996年首创，该方法利用了PCR灵敏、快速、简便的特点，已经成为当前检测DNA甲基化的最常用方法之一。MSP技术检测基因甲基化状态敏感度高，并且可以避免限制性酶切不全所带来的假阳性结果，能同时检测多个CpG位点的甲基化情况，是研究基因甲基化的较为实用的技术。而MSP结合测序方法不仅能明确甲基化的确切位置和甲基化程度，而且更敏感，需要的DNA少，能用于少量DNA的甲基化分析，因而给甲基化检测提供方便。Estelle等[13]曾尝试应用MS-PCR法，取随机人群的血清、尿液、气管分泌液、淋巴结组织活检标本做基因甲基化检查，结果具有早期诊断意义，部分病例在肿瘤确诊之前就已经明确报告甲基化阳性。本实验结果表明，乳腺癌组织较正常乳腺组织ERα基因启动子A、B区甲基化率显著增高，ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组的均显著增加，ERα启动子A、B区甲基化与ER蛋白表达均呈显著的负相关。因此，ERα启动子A、B区的甲基化状态不仅可以早期预测乳腺组织有无恶性变化的可能，而且对于ERα阳性乳腺癌，可以在ERα向阴性转变之前发现恶性肿瘤复发的可能。乳腺癌细胞系的研究表明，去甲基化药物可以使乳腺癌细胞的ER恢复表达，恢复对抗雌激素疗法的敏感性，从而提高乳腺癌内分泌治疗的有效率[14]。因此，ER启动子区CpG岛的甲基化状况可以作为去甲基化治疗的指征，依据患者甲基化的检测结果，可以进行去甲基化治疗，使ER转阳，提高内分泌治疗有效率。由于近年来，应用DNA甲基化标志进行临床癌症检测和诊断已经取得了显著的进展。总之，检测ERα启动子区的甲基化状态，因其具有高灵敏度，操作简便，快速，检测标本要求低等特点，可以作为乳腺癌早期诊断、分型、复发的生物学指标，选择内分泌治疗的预测因子以及提高内分泌治疗有效率的方法。
本研究结果显示，ERα启动子甲基化率与乳腺癌淋巴结转移与否无显著相关，提示ER基因甲基化与乳腺癌的转移潜能无关。本研究结果在12例ER表达阴性的乳腺癌中，分别有4例、5例未检测到ERα启动子A区、B区甲基化，提示ERα失表达还可能与其他位点甲基化有关，或者还有其他一些机制参与，DNA甲基化并不是其蛋白失表达的唯一机制，而是多种机制共同参与的结果。
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