作者：李笑蓉，李宁，吴彬，王小同，陈江帆
【摘要】 目的：观察慢性低O2高CO2小鼠脑组织超微结构改变及神经炎症因子表达，探讨腺苷A2A受体与神经系统炎症的关系。方法：实验动物随机分为6组：对照野生组（NC+/+）；对照杂合组（NC+/-）；对照敲除组（NC-/-）；低O2高CO2 4周野生组（4HH+/+）；低O2高CO2 4周杂合组（4HH+/-）；低O2高CO2 4周敲除组（4HH-/-）。利用野生型、A2A受体敲除型小鼠进行对照实验，电镜观察脑组织中神经胶质细胞改变以及外源性炎症细胞浸润；采用RT-PCR方法测定皮层和海马中TNF-αmRNA、IFN-γmRNA、TGF-β1 mRNA的表达。结果 ：电镜示4HH+/+组比NC+/+组星形胶质细胞数量明显增加，形态以凋亡为主，同时可见足突明显水肿，少突胶质细胞水肿、空泡形成、髓鞘疏松；4HH-/-组比4HH+/+组凋亡的星形胶质细胞数量减少，形态仅轻度异常，未见明显水肿；实验动物脑内未见外周炎症细胞浸润。与相应小鼠表型的对照组比较，RT-PCR分析显示低O2高CO2 4周各组的皮层及海马的TNF-αmRNA、IFN-γmRNA表达上调（P＜0.05）；与4HH+/+组比较，4HH-/-组海马TNF-αmRNA表达上调不显著（P＜0.05）。结论：慢性低O2高CO2小鼠脑组织存在程度不等的凋亡与炎症现象，腺苷A2A受体基因敲除可能通过抑制TNF-αmRNA表达等起到神经保护作用。
【关键词】 低氧；高碳酸血症；炎症；腺苷A2A；肿瘤坏死因子α；干扰素γ；转化生长因子β1； 小鼠
Abstract: Objective: To examine the ultrastructural changes and expression of neuroinflammatory cytokines after exposure to chronic hypoxic hypercapnia，a mouse model of COPD，and to further investigate the effect of genetic inactivation of adenosine A2A receptor on these pathological changes. Methods: Mice were randomly pided into three control groups: the control wild-type group (NC+/+) ； control heterozygous knockout group (NC+/-) ；control homozygous knockout group (NC-/-) and three hypoxic hypercapnia 4-week groups: hypoxic hypercapnia wild-type group (4HH+/+) ； hypoxic hypercapnia heterozygous knockout group (4HH+/-) and hypoxic hypercapnia homozygous knockout group (4HH-/-). The ultrastructural changes in glias， the infiltration of exogenous inflammatory cells in the brain of wild type and A2A receptor knockout mice were observed by electron microscope. The expression of TNF-αmRNA， IFN-γmRNA， TGF-β1 mRNA in cortex and hippocampus was determined by RT-PCR in these mice. Results: Compared with that in the NC+/+ group，the number of astrocytes with apoptotic characteristics was increased in the 4HH+/+ group， and edema of the foot process in astrocytes and edema、vacuolization in oligodendrocytes and rarefaction of myelin sheath were seen clearly. Interestingly， compared with the 4HH+/+ group， the 4HH-/- group had significantly less apoptotic astrocytes with reduced edema and mild morphological changes. However，there was no infiltration of peripheral inflammatory cells in every group. The expression of TNF-αmRNA， IFN-γmRNA in cortex and hippocampus was significantly increased in three 4HH groups compared with their corresponding control groups by RT-PCR (P &<0.05). Compared with the 4HH +/+ group， the expression of TNF-α mRNA in hippocampus was increased unsignificantly in the 4HH-/- group (P &<0.05). Conclusion: Inflammation and apoptosis in mice’s brain can be induced by chronic hypoxic hypercapnia. Adenosine A2A receptor knockout may be of protection after mice’s exposure to chronic hypoxic hypercapnia by modulating neuroinflammation.
Key words: hypoxia； hypercapnia； inflammation； adenosine A2A； TNF-α；IFN-γ；TGF-β1；mouse
慢性低O2高CO2引起认知功能障碍的病理生理机制目前尚未十分清楚。有学者认为神经细胞凋亡可能是慢性低O2高CO2导致大鼠学习记忆障碍的神经生物学机制之一[1]。国外大量研究已证实腺苷A2A受体活化在外周组织器官主要通过抑制炎症反应等途径表现为保护效应，而拮抗腺苷A2A受体在中枢神经系统可产生神经保护作用，其可能的机制之一是通过抑制神经炎症反应[2]。邵胜敏等观察到慢性低O2高CO2可引起大鼠神经元及胶质细胞水肿等现象，故本实验采用慢性低O2高CO2模拟COPD的小鼠模型来探讨腺苷A2A受体与神经炎症的关系。
1 材料和方法
1.1 动物分组 C57BL/6小鼠，SPF级，野生型小鼠16只，杂合型小鼠16只，腺苷A2A受体敲除型（A2AR KO）小鼠16只，雌雄配对，4～6个月龄，约26 g（温州医学院实验动物中心提供）。各随机分为2组：对照野生组（NC+/+）；对照杂合组（NC+/-）；对照敲除组（NC-/-）；低O2高CO2 4周野生组（4HH+/+）；低O2高CO2 4周杂合组（4HH+/-）；低O2高CO2 4周敲除组（4HH-/-），每组8只。
1.2 模型建立 置于低O2高CO2舱中(吸入气O2浓度为9%～11%，CO2浓度为5.0%～6.0%)，每天8 h。其余时间与对照组在同一室内(室温15～20 ℃，相对湿度50%～70%)，持续4周。
1.3 电镜观察 腹腔注射水合氯醛行全身麻醉，仰卧固定，生理盐水心脏灌注，断头取脑，沿正中线分为左右两半，一侧做电镜，另一侧做RT-PCR。在一侧大脑前额叶切取1 mm×1 mm×2 mm大脑皮质，移入2.5%戊二醛固定液，EPON812包埋，LKB-V型超薄切片机切片，常规染色，H-600型透射电镜观察脑超微结构改变。
1.4 RNA抽提 取脑组织50～100 mg，根据Trizol reagent(Invitrogen)的说明一步法抽提总RNA。提取得到的RNA溶于20μL的1‰焦磷酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水，取5μL稀释20倍，用紫外分光光度计测RNA的量和纯度，取A260/A280 在1.8～2.0的RNA样品进一步实验。
1.5 RT-PCR RNA提取后根据RT-PCR试剂盒说明合成cDNA。PCR引物由上海生工生物有限公司设计并合成，TNF-α引物：上游5’-GCGACGTGGAACTGGCAGAAG-3’，下游5’-GGTACAACCCATCGGCTGGCA-3’，扩增片段304 bp；IFN-γ引物：上游5’-TCCTGCAGAGCCAGATTATCTCT-3’，下游5’-ACCTCAAACTTGGCAATACTCATG-3’， 扩增片段169 bp；TGF-β1引物：上游5’- GGCGGTGCTCGCTTTGT-3’，下游5’-GCTGATCCCGTTGATTTCC-3’，扩增片段496 bp；内参为β-肌动蛋白（β-actin），有两个引物序列：内参1上游5’-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3’，下游5’-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’，扩增片段281 bp；内参2上游5’-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3’，下游5’-GGATTCCATACCCAAGAAGGAA-3’，扩增片段470 bp。 cDNA根据试剂盒说明书采用20μL反应总体系扩增得到PCR产物。取PCR 产物5μL用2%的琼脂糖凝胶（EB，0.5μL·mL-1）电泳，凝胶成像，smartview分析目的基因与β-actin的灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。
1.6 统计学处理方法 NC及4HH各三组间比较用单因素方差分析，方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用Tamhane检验。NC组与4HH组相应小鼠表型比较用t检验。
2 结果
2.1 电镜观察
2.1.1 星形胶质细胞：NC+/+组细胞核呈圆形或椭圆形，细胞核大，核膜不规则，细胞电子密度高，着色深，胞浆内质网扩张明显，少量溶酶体，毛细血管周围星形胶质细胞足突着色深，无水肿，与血管壁紧密连接（见图1）；NC-/-组部分血管周围星形胶质细胞足突出现明显的局灶性水肿，胞浆中高尔基体、溶酶体多，早中期凋亡的星形胶质细胞多见；4HH+/+组以核固缩、胞浆空泡形成为主（见图2），血管周围星形胶质细胞足突明显水肿（见图3）；4HH-/-组细胞着色深，核固缩，凋亡星形胶质细胞数量较4HH+/+组少，星形胶质细胞数量明显增加，形态接近正常或仅轻度异常，仅见血管周围星形胶质细胞足突水肿，胞浆线粒体等细胞器未见水肿。
2.1.2 少突胶质细胞：NC+/+组细胞核呈椭圆形，细胞电子密度较星形胶质细胞低，胞浆含线粒体、微丝、游离核糖体，突起较少（见图4）；NC-/-组细胞核正常，胞浆轻度水肿、疏松、空泡形成，内质网极度扩张；4HH+/+组细胞核体积增大，着色浅（细胞核水肿），胞浆水肿、空泡形成、髓鞘疏松（见图5）；4HH-/-组基本正常，未见明显水肿。
2.1.3 小胶质细胞：NC组未见；4HH+/+组细胞呈圆形，细胞核体积小，着色深，核内染色质分布致密，胞浆溶酶体丰富，未见典型突起，提示小胶质细胞不活跃（见图6）；4HH-/-组少见，不活跃。
2.2 皮层及海马TNF-α mRNA，IFN-γ mRNA，TGF-β1 mRNA的表达 与NC相应小鼠表型组相比，4HH各组小鼠皮层及海马TNF-αmRNA，IFN-γmRNA表达均上调，P＜0.05（见图7、8），TGF-β1 mRNA表达差异无显著性（见图9）；而4HH-/-组与4HH+/+组相比，海马TNF-α mRNA表达下降，P＜0.05（见图7）（见表1、2）。
3 讨论
在慢性低O2高CO2模拟的COPD动物模型中，行为学实验显示其空间学习记忆和工作记忆受损，尤其以短时空间记忆受损严重[3-4]。另外，大鼠海马CA1区、CA3区和皮层区NMDAR1 mRNA的表达水平分别减少了21.4%、18.4%和18.1%，大鼠海马及皮层区CREB mRNA表达水平减低，以4HH组海马最显著，推测慢性低O2高CO2可能通过下调海马区的NMDAR1 mRNA、CREB mRNA的表达水平而导致学习记忆障碍[4-5]。目前有研究报道认为神经细胞凋亡可能起着重要的作用；理论上低O2高CO2使实验动物的大脑乳酸根浓度明显增加及葡萄糖浓度明显减少导致的大脑能量代谢障碍，以及脑内出现的炎症反应等因素可能与慢性低O2高CO2导致的认知功能障碍密切相关，但目前尚无相关研究支持。故本实验主要对中枢神经系统（CNS）炎症方面进行深入研究。
CNS炎症的典型表现是小胶质细胞、星形胶质细胞的激活及细胞因子的表达和释放[6-7]。在CNS中，免疫炎症反应由CNS固有的免疫细胞（胶质细胞）和透过血脑屏障的外周白细胞一起介导。而本研究中电镜显示实验组星形胶质细胞明显增多，但未见外周炎症细胞浸润，可能是因为慢性低O2高CO2时，血脑屏障以纤维增生为主，通透性较急性期时明显下降，导致外周炎症细胞无法浸润到CNS[8]。由此推测慢性低O2高CO2导致的CNS免疫炎症反应主要由胶质细胞来介导。另外，本研究发现4HH+/+组比NC+/+组星形胶质细胞数量明显增加，形态以凋亡为主，同时可见足突明显水肿；少突胶质细胞出现明显水肿、空泡形成、髓鞘疏松，促炎因子水平升高，提示慢性低O2高CO2 4周时小鼠CNS存在程度不等的炎症与凋亡现象。这与大鼠模型中观察到的病理改变是一致的，结合行为学研究结果推测小鼠CNS存在的炎症和凋亡反应可能与慢性低O2 高CO2导致认知功能障碍有关。
当CNS缺血低氧时，细胞外腺苷浓度升高，引起胶质细胞上腺苷A2A受体活化并产生许多复杂的效应。腺苷A2A受体活化可能具有潜在的不利因素，相反，腺苷A2A受体拮抗或基因敲除则可能通过抑制CNS炎症起神经保护作用[9-10]。咖啡因为非选择性腺苷A1与A2A受体拮抗剂，小剂量咖啡因主要是通过拮抗腺苷A2A受体发挥生物学作用。慢性低O2高CO2大鼠模型中、小剂量咖啡因干预能明显促进短期学习记忆及空间记忆的恢复[7]，说明拮抗腺苷A2A受体能提高COPD大鼠学习记忆能力。而本实验发现4HH-/-组小鼠脑组织超微结构改变及其海马中TNF-α表达上调均不及4HH+/+组小鼠明显，提示腺苷A2A受体基因敲除使小鼠CNS炎症反应有所抑制，这与小剂量咖啡因干预下的大鼠行为学改善也十分一致。由此推测在慢性低O2高CO2情况下，小鼠的腺苷A2A受体基因敲除可能具有CNS保护作用，而通过抑制TNF-α等CNS炎症反应可能是其作用机制之一。
参考文献
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