作者：黄唯佳，陈寿权，周世方，李章平，王万铁，章杰，晏平，李惠萍，程俊彦
【摘要】 目的：探讨心肺复苏后大鼠血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）的变化、大脑皮层病理改变及乌司他丁的干预作用。方法：成年雄性SD大鼠120只，随机分为假手术对照组、复苏组、乌司他丁组（药物组），每组按气管切开后（对照组）或自主循环恢复（ROSC）后（复苏组、药物组）0.5、3、6、12 h和24 h分为5个亚组（n=8）。复苏组和药物组采用窒息致大鼠心脏骤停和心肺复苏模型，药物组于ROSC后2 min内经颈动脉推注乌司他丁（100 000 U/kg）。对照组仅行麻醉、气管切开和血管穿刺。各组分别于各时间点取血和组织标本，以ELISA法检测血清NSE浓度，光镜下观察大脑皮层的病理改变。结果：与对照组比较，复苏组和药物组ROSC后各亚组各时间点血清NSE含量明显升高（P &<0.05或P &<0.01）；与复苏组比较，药物组ROSC后6、12、24 h血清NSE含量显著降低(P &<0.05或P &<0.01)。药物组病理损害轻于复苏组。结论：乌司他丁通过降低血清NSE浓度对心肺复苏后脑损伤具有一定的保护作用。
【关键词】 心肺复苏；神经元特异性烯醇化酶；乌司他丁；脑损伤
Abstract: Objective: To investigate the serum concentration of neuron-specific enolase (NSE) and the histopathological changes of cerebral cortex in asphyxia rats with bolus ulinastatin for injection after cardiopulmonary resuscitation (CPR). Methods ：One hundred and twenty male adult SD rats were randomly pided into 3 groups: sham-operation control group， CPR group and Ulinastatin group. Each group was pided into 5 subgroups (n =8) by various intervals (at 0.5，3，6，12，24 h after tracheotomy in control group or after ROSC in CPR group and ulinastatin group). Asphyxiation cardiac arrest and CPR model was used in CPR group and Ulinastatin group，with bolus ulinastatin for Injection 100 000 U/kg via arteria carotis within 2 min after ROSC. Anaesthesia，tracheotomy and vascular centesis were performed in rats without asphyxiation in sham-operation group. Samples were taken at each intervals of subgroups. Serum levels of NSE were measured with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The pathological changes of cortex were observed under light microscope. Results ：The serum levels of NSE elevated significantly after ROSC in CPR group and ulinastatin group than those in control group (P &<0.05 or P &<0.01). Serum NSE level decreased at 6，12 and 24 h after ROSC in ulinastatin group compared with CPR group (P &<0.05 or P &<0.01). There were milder pathological changes in ulinastatin group than those in CPR group. Conclusion：Ulinastatin can alleviate cerebral injury after cardiopulmonary resuscitation by decreasing the level of serum neuron-specific enolase.
Key words: cardiopulmonary resuscitation；neuron-specific enolase；ulinastatin；cerebral injury
神经元特异性烯醇酶(neuron specific enolase，NSE)是神经元损伤的敏感性指标，具有高度特异性。有研究表明血清NSE水平与心脏骤停后脑损伤程度密切相关，可作为评价脑损伤程度及预后的早期敏感指标[1-3]。乌司他丁（ulinastatin，UTI）能减轻炎症反应，清除氧自由基，对脑损伤具有保护作用[4]。本实验采用窒息型大鼠心肺复苏（CPR）模型，观察了大鼠CPR后血清NSE蛋白及脑组织病理改变及乌司他丁的干预作用，以进一步明确乌司他丁对CPR后脑损伤的保护作用及其机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 成年雄性SD大鼠120只（由温州医学院实验动物中心提供），体重300～400 g，平均（355.3±23.1）g，随机分为假手术对照组、复苏组、药物组，再分别按气管切开后（对照组）或自主循环恢复（ROSC）后（复苏组、药物组）0.5、3、6、12、24 h分为5个亚组，每个亚组8只。术前禁食12 h，自由饮水。
1.2 大鼠心肺复苏模型制作及处理 采用窒息法并加以改进建立大鼠心肺复苏模型[5]。以5%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射诱导麻醉继以0.1 g·kg-1·h-1补充麻醉。实验参数设计和记录均参照复苏实验研究的Utstein模式[6]。复苏组和药物组于呼气末夹闭气管插管，待大鼠心跳停止（心电图呈室颤、停搏或电机械分离，颈动脉平均动脉压&<30 mmHg）5 min后开放气道，进行CPR，并快速经颈动脉推注肾上腺素20μg/kg，出现自主心律、脉搏波且颈动脉平均动脉压&>60 mmHg并持续10 min以上判断为ROSC。药物组在ROSC后2 min 内经颈动脉推注乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司，国药准字H19990134）100 000 U/kg，复苏组推注等量生理盐水。对照组动物仅行麻醉和气管插管、血管穿刺，不进行夹管窒息及CPR。空调控制室温23～26 ℃。各组大鼠体重、水合氯醛麻醉用量、基线血压、肾上腺素用量等参数比较，差异均无显著性(均P &>0.05)。
1.3 血清NSE蛋白含量测定 按各分组时间点取大鼠颈动脉血2 mL，静置后离心（4 000 r/min，10 min），取上清液于EP管，置于－70 ℃冰箱保存，待测。采用ELISA法测定血清NSE蛋白浓度，试剂盒购自美国USCNLIFE公司，测定步骤严格按试剂盒操作说明进行。
1.4 大脑枕叶皮层组织病理观察 各时间点取血后大鼠活去脑，取左侧枕叶皮层约5 mm×5 mm大小组织块，置于10%福尔马林中固定24 h后，脱水、包埋，常规石蜡切片，片厚4μm，HE染色，脱水，封片后光镜观察并照相。
1.5 统计学处理方法 采用单因素方差分析，方差齐性用Levene检验。
2 结果
2.1 各组血清NSE蛋白含量变化 与对照组比较，复苏组和药物组ROSC后0.5 h起血清NSE蛋白含量即开始升高，至24 h各时间点一直呈持续上升趋势，差异均有显著性（P&<0.05或P&<0.01）；与复苏组相比，药物组ROSC后6、12、24 h显著降低(P&<0.05或P&<0.01)（见表1）。
2.2 大脑枕叶皮层组织病理改变 光镜下，对照组神经元及胶质细胞大小正常，形态结构清晰，锥体细胞突起明显，细胞内结构清晰（见图1a）；复苏组ROSC后12 h神经元固缩、深染，细胞内结构不清，细胞周围空隙明显增大，胶质细胞周围间隙扩大，空泡样改变，血管周围间隙扩大（见图1b）；药物组ROSC后12 h脑组织病理改变要轻于复苏组，神经元大小基本正常，形态及细胞内结构模糊，胶质细胞轻度水肿，细胞和血管周围空隙有增大（见图1c）。
3 讨论
近年来，随着心肺复苏技术的进步和药物的不断更新，心肺复苏的成功率有所提高，但最终的出院生存率仍然为2%～14%，主要原因是心肺骤停后所引起的脑损害。心肺复苏的本质就是全身组织器官的缺血再灌注损伤，而脑组织对缺血低氧最敏感。心肺骤停后血流中断启动了脑损害，循环恢复后脑组织又经历了无复流期、反应性充血期、延迟性低灌注期，这是脑缺血低氧损害的最重要阶段，此期可持续2～12 h[7]。本实验见光镜下ROSC 12 h后皮层神经元固缩、深染，细胞内结构不清，细胞周围空隙明显增大，胶质细胞周围间隙扩大，空泡样改变，血管周围间隙扩大，提示ROSC 12 h脑组织损伤达到一高峰。
NSE是糖酵解过程中烯醇化酶的同工酶，特异性分布于神经元及神经内分泌细胞中，是神经元的特异性标志物。正常情况下，脑脊液和血清中有少量的NSE存在。当脑缺血、低氧、中毒或创伤时，神经细胞膜的完整性受到破坏，且血脑屏障的通透性增加，NSE蛋白会泄漏到血清或脑脊液中，含量出现明显变化。研究表明，血清NSE水平同脑脊液NSE水平存在高度相关性，故检测血清NSE可确切反映脑组织的损伤程度[8]，且可用作评价CPR后脑损伤的早期诊断指标[9]，并可预测心肺复苏患者脑损伤程度[10]以及出院生存率和神经功能恢复情况[11-12]。本实验观察到ROSC 0.5 h后血清NSE浓度明显升高，3、6、12、24 h持续升高，提示ROSC 0.5 h后神经元细胞已有破坏，随着再灌注时间的推移，神经元损伤增多，释放NSE进入外周血亦随之增多。此外，从变化趋势看，ROSC后0.5 h，NSE蛋白在血清中的含量随时间的推移而逐渐增高，病理切片上神经细胞损伤的情况也逐渐加重，但血清学的变化更为敏感。因此，血清NSE蛋白的动态变化可以较好地反映出神经细胞损伤情况。
乌司他丁是一种广谱的水解酶抑制剂，能抑制炎症递质的过度释放，清除氧自由基，减轻再灌注损伤，半衰期为40 min，给药后6 h给药量的24%从尿中排泄。我们已研究证明，乌司他丁可以通过调节肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-10)等炎性细胞因子的水平对大鼠心肺脑复苏后脑损伤起到一定的保护作用[13]。本实验研究显示，药物组血清NSE ROSC后6、12、24 h较复苏组显著减低，光镜示，与复苏组比较，药物组ROSC后12 h皮层神经元及神经胶质细胞，细胞及血管间隙变窄，提示乌司他丁可能通过稳定细胞及微粒体膜，清除氧自由基，减轻血脑屏障通透性，降低血清NSE水平，减轻缺血低氧对脑组织的损害。ROSC后24 h复苏组与药物组大脑枕叶皮层组织病理改变差别不明显，考虑与乌司他丁半衰期有关，但最适宜的给药时间有待进一步研究。
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