作者：房春燕，代允义，宋兴伟，王小同
【摘要】 目的：探讨低O2高CO2对小鼠血脑屏障通透性、超微结构及水通道蛋白-4（AQP4）表达的影响。方法 ：雄性成年C57BL/6小鼠，随机分为对照组（C组）、实验组(低O2高CO2 1 d、2 d、3 d、1周、2周组)，实验组动物置于低O2高CO2舱造模。小鼠腹腔注射荧光素钠，观察不同时间点血脑屏障通透性的变化，电镜观察血脑屏障超微结构的变化，免疫组化及RT-PCR分别检测小鼠前额叶皮层及海马AQP4蛋白及mRNA表达的变化。结果 ：实验1 d组小鼠血脑屏障的通透性升高最明显，然后逐渐下降，在1周内仍显著高于对照组（P&<0.05或P&<0.01），2周末回落至对照组水平（P &>0.05）。实验1 d组小鼠血脑屏障超微结构有明显改变，皮层及海马脑组织AQP4蛋白及mRNA表达显著增高（P &<0.05）。结论 ：低O2高CO2在早期能使小鼠血脑屏障的通透性升高，可能与AQP4的表达增高有关。
【关键词】 血脑屏障；低氧；高碳酸血症；水通道蛋白-4：星形胶质细胞；小鼠
Abstract: Objective: To investigate the changes of the permeability and ultrastructure of mice’s blood-brain barrier (BBB) and expression of aquaporin-4 (AQP4) caused by hypoxic hypercapnia. Methods: The male adult C57BL/6 mice were randomly pided into six groups: the control group (C)，the hypoxic hypercapnia 1 d， 2 d， 3 d， 1 w and 2 w group. Experimental mice were exposed to normobaric hypoxic hypercapnia by placing them in a chamber. Sodium fluorescein (NaFI) was injected intraperitoneally to detect the permeability of BBB. The BBB ultrastructure was observed by electron microscope. The expression of AQP4 mRNA and protein levels were measured by Immunochemistry and PT-PCR. Results: Compared with C group， the permeability of mice’s BBB increased significantly in 1 d， 2 d， 3 d and 1 w group（P&<0.05 or P &<0.01），which declined gradually with the prolongation of hypoxic hypercapnic exposure and had no significant increase in 2 w group. BBB ultrastructure changes were observed by electron microscope and mRNA and protein of AQP4 were upregulated significantly in 1 d group (P&<0.05). Conclusion: The blood-brain barrier’s permeability may increase with mice’s exposure to hypoxic hypercapnia at early stage， which may have the relationship to the upregulaion of AQP4.
Key words: blood-brain barrier；hypoxia；hypercapnia；aquaporin-4；astrocyte；mouse
血脑屏障功能的调节与星形胶质细胞的足突密切相关[1]。水通道蛋白4（AQP4）是一种跨膜蛋白，在星形胶质细胞的足突上呈极化表达，是水分进出星形胶质细胞的主要通道之一。以往的研究证明，在慢性低O2高CO2条件下，实验动物认知功能发生损害[2]，其是否与血脑屏障的破坏有关，鲜见报道。本实验通过建立低O2高CO2小鼠模型，研究血脑屏障的变化及其与AQP4的关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及造模 雄性C57BL/6小鼠，10周龄，体重22～27 g，共64只，温州医学院SPF级实验动物中心提供。动物随机分为对照（C）、实验1 d、2 d、3 d、1周、2周组。将实验组小鼠置于常压低O2高CO2舱内，通过氮气调节舱内O2浓度，使其维持在9%～11%，通入CO2使其浓度维持在5%～6%，每天8 h，其余时间与对照组置于同一室内（室温20～25 ℃，相对湿度50%～70%）。
1.2 透过血脑屏障荧光素钠测定 参照Olsen等[3]的方法，对照组及出舱小鼠（n=6）即刻注射10% NaFI（Sigma Aldrich），0.1 mL，45 min后处死。4%水合氯醛腹腔注射麻醉，下腔静脉取血，血标本4 ℃静置约30 min，4 500 r/min离心10 min，取上清。打开胸腔，经左心室插管至主动脉，右心房剪口，生理盐水灌注，直至右心房流出清亮液体为止。断头取脑，脑组织加入0.6 mL PBS匀浆，3 000 r/min离心5 min，取上清。血清样品与脑样品用20% TCA 1:10稀释，4 ℃孵育24 h后，样品10 000 r/min离心15 min，取上清，用同体积的Tris-Hcl缓冲液稀释（0.1 mol/L，pH=8）。测荧光强度（490 nm，514 nm）。血脑屏障通透性用每克脑组织中NaFI含量与每mL血清中NaFI含量的比值来测定。标准曲线用已知NaFI含量的含10% TCA与0.05 M Tris缓冲液的脑组织匀浆上清液来绘制。
1.3 电镜超微结构观察 取实验1 d组与对照组小鼠（n=2），用4%水合氯醛腹腔麻醉，经左心室插管至主动脉，4%新鲜配制的多聚甲醛灌注固定，待鼠体僵硬，冰盘上大脑皮质修块约1 mm3大小，浸泡于2.5%的戊二醛，24 h后，1%锇酸后固定，系列丙酮梯度脱水，Epon812包埋，LKB-V型超薄切片机切片，常规染色，H-7500型透射电镜观察。
1.4 免疫组化测定AQP4蛋白 取实验1 d组与对照组小鼠（n=6），先生理盐水灌注，后4%多聚甲醛灌注固定。从视交叉处脑组织冠状切，置于4%多聚甲醛后固定，脱水包埋，制作4μm厚的石蜡切片。组织切片经脱蜡至水，高温高压修复4 min，3%的过氧化氢除内源性过氧化酶，分别加兔抗AQP4(1∶200，美国santacruz公司)4 ℃过夜，加辣根过氧化物酶标记二抗37 ℃孵育30 min后， DAB显色(DAB及二抗购自北京中杉生物技术公司)，苏木素复染、透明、封片。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。显微镜下棕黄染色为阳性表达，每张切片选皮层、海马各3个高倍视野进行观察，计算平均光密度值。
1.5 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测AQP4 mRNA 取实验1 d组与对照组小鼠（n=6），用TRIzol提取组织总RNA，逆转录试剂盒(大连宝生物公司提供)进行逆转录，所得cDNA加入AQP4引物，用Takara Taq酶扩增，以MBA为内参照。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，AQP4和MBA均为31次循环，最后72 ℃延伸5 min。AQP4引物上游序列为5’-TCTTTTGGACCCGCAGTTAT-3’，下游序列为5’-CCACTTGGCTCCGGTTGT-3’，扩增片段长度为214 bp；MBA引物上游序列为5’-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3’，下游序列为5’-GGATTCCATACCCAAGAAGGAA-3’，扩增片段长度为470 bp。扩增产物用质量分数为115%的琼脂糖凝胶证实，测定其A值，计算目的条带与内参照的A值比。
1.6 统计学处理方法 多组间比较采用单因素方差分析；两组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 血脑屏障通透性变化（见图1） 低O2高CO2能使小鼠血脑屏障的通透性快速增高，1 d组升高最明显，然后逐渐下降，在1周内仍显著高于对照组（P&<0.05或P&<0.01），2周末才回落至对照组水平（P&>0.05）。
2.2 电镜观察（见图2） 对照组小鼠血脑屏障血管内皮细胞结构完整光滑，细胞间有紧密连接存在，表现为相邻细胞间深染致密条带，内皮细胞外基膜连续。周围脑组织未见病理改变。实验1 d组，大脑皮质毛细血管内皮细胞吞饮泡增多，基底膜疏松密度不均，紧密连接松弛，胶质细胞足突肿胀。周围神经纤维部分肿胀。
2.3 AQP4免疫组化蛋白表达（见表1，图3） AQP4蛋白在对照组小鼠脑前额叶皮质及海马呈阳性表达，实验1 d组AQP4蛋白表达增多，染色增强，与对照组相比，差异有显著性（P&<0.05）。
2.4 AQP4 mRNA表达（见表1，图4） 实验1 d组AQP4 mRNA表达升高，与对照组比较差异有显著性（P&<0.05）。
3 讨论
血脑屏障是位于脑与血液之间的屏障，对于维持脑组织内环境的稳态起着重要作用。中枢神经系统的低氧、炎症及变性等，都会引起血脑屏障的破坏[4]。荧光素钠是一种小分子荧光示踪剂，分子量376 D，正常情况下不能透过血脑屏障[3]。本试验显示，低O2高CO2能使小鼠血脑屏障的通透性快速增高，1 d组升高最明显，然后逐渐下降，在1周内仍显著高于对照组，2周末才回落至对照组水平。电镜下实验1 d组小鼠星形胶质细胞的足突水肿明显，基底膜疏松，血管内皮的紧密连接变得松弛，也显示了低O2高CO2对小鼠血脑屏障的结构损害。以上结果表明，低O2高CO2引起的血脑屏障的破坏主要是在早期，可能由于反复常氧间歇及对低氧的适应，血脑屏障存在修复代偿，其机制尚有待于进一步的研究。
AQP4是脑组织中含量最多的水通道蛋白，是水分进出脑组织的主要通道[5]，它在紧贴微血管与室管膜上皮的星形胶质细胞的足突上的极化表达，提示它在水分进出血脑屏障及脑-脑脊液屏障方面有重要的作用[6]。在病理情况下血脑屏障破坏常伴有星形胶质细胞上AQP4的表达增高[7-8]。AQP4可以使脑组织在脑缺血低氧、感染、创伤、肿瘤、蛛网膜下腔出血等情况下产生病理性的水肿。关于AQP4与血脑屏障损害的关系观点不一，有人发现AQP4在缺血低氧等病理情况下表达增高[9]，并加重了细胞源性脑水肿从而使星形胶质细胞对血脑屏障的调控作用减弱，血脑屏障发生破坏；也有人发现在缺血低氧模型中脑组织AQP4蛋白表达降低[10-11]，使水的清除减少，从而加重水肿。Nicchia等[12]的实验显示血脑屏障破坏同时AQP4表达增高，阻止血脑屏障破坏后AQP4表达减少，提示血脑屏障的破坏诱导了AQP4的表达；Ke等[13]认为是AQP4的表达升高引起了血脑屏障的破坏。我们的实验显示，低O2高CO2 1 d组小鼠脑组织AQP4 mRNA与蛋白表达均明显增高。AQP4的高表达促使水分进入星形胶质细胞增多，引起细胞水肿，说明AQP4影响血脑屏障的功能、星形胶质细胞对水的通透调控，但是究竟是AQP4的表达增高引起血脑屏障的破坏，还是血脑屏障的破坏诱导了AQP4的表达增高需进一步研究证实。
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