芳香化酶在人精子中的表达与精子功能状态的关系

　　　　 作者：郑洁，何彦芳，岳利民，何亚平，张金虎

【摘要】 　　目的 研究芳香化酶表达与精子功能状态和受精力的关系。方法 采用流式细胞术检测精子中的芳香化酶水平，以SPA试验检测精子的受精力、三色法染色观察顶体反应率。结果 精子芳香化酶水平与受精率、顶体反应率都有一定的相关性，其相关系数分别为0.5319和0.5114。正常男性与不明原因不育症患者精子芳香化酶阳性率分别为41.32±18.99%和27.72±11.69%， 差异有显著性（Ｐ＜0.01）。结论 芳香化酶对于正常的精子功能有重要意义，芳香化酶表达异常可能与某些不明原因不育有关。

【关键词】 芳香化酶 人精子 受精 顶体反应

　　ABSTRACT Objective To study the expression of aromatase and its relationship with the functional states of spermatozoa and fertility.Methods Flow cytometry was applied to detect the level of aromatase in sperm， SPA test to detect the fertility of sperm and triple stain technique to observe the acrosome reaction rate. Results　　The level of aromatase was of certain correlation with fertility rate and acrosome reaction rate with the correlated coefficients of 0.5319 and 0.5114 respectively; the positive rate of aromatase in spermatozoa of normal males and infertile males with unknown causes were 41.32±18.99% and 27.72±11.69% respectively， the difference was of significance (Ｐ＜0.01). Conclusions　　Aromatase is of important significance for normal sperm function; the abnormal expression of aromatase may be related with infertility of unknown causes.

　　KEYWORDS aromatase　　 human sperm　　 fertilization　　 acrosome reaction

　　芳香化酶是雄激素合成雌激素过程中的关键酶，它由细胞色素P450芳香化酶（P450arom）和NADPH-细胞色素P450还原酶两种成分组成。本实验采用流式细胞术检测人精子中芳香化酶的表达，以探讨芳香化酶表达对于实现正常精子功能的意义，及其异常表达与男性不育症发生的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 标本来源 生育组：18例身体健康，有近期生育史的正常成年男性，年龄25～45岁，其精液常规各项指标符合WHO制定的正常精液常规标准［1］；不育组：21例婚后2年以上未育，已排除女方不孕因素，且精液常规各项指标在正常范围的不明原因不育患者。

　　1.1.2 人正常睾丸组织 1例因前列腺癌而切除的睾丸，取其正常组织，经病理切片检查证实无病理学改变后，于-70℃保存备用。

　　1.1.3 试剂 Percoll为Pharmacia公司产品，一抗（羊抗人芳香化酶CYP19）、二抗（异硫氰荧光素标记的兔抗羊IgG）为Santa Cruz公司产品。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 精子的制备 采用80%∶40% (v∶v) 的Percoll梯度分离精子［1］。收集80%密度层底部的精子，用含0.3% HSA的BWW液将其洗涤两次。

　　1.2.2 流式细胞术检测精子的芳香化酶阳性率 2%甲醛溶液固定，0.1% Triton X-100打孔，5% BSA封闭，分别与一抗（1∶50）、二抗（1∶25）孵育后，调细胞密度至1×106/ml，流式细胞仪检测芳香化酶阳性的精子百分率。以上每一步的洗涤和试剂的配制都使用含0.1%BSA的PBS。用含1% BSA的PBS代替一抗作为空白对照，其余处理步骤同测定管。

　　1.2.3 SPA 姬姆萨染色 根据总卵数及受精卵数，计算受精率。

　　1.2.4 三色法染色 每张涂片计数200个精子，计算顶体反应的发生率。

　　1.2.5 统计分析 所有结果都以均数±标准差表示；采用相关分析法分析精子芳香化酶阳性率与受精率、顶体反应率的相关性；正常组与不育组间的比较采用t检验。Ｐ＜0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果

　　2.1 相关性分析 精子的芳香化酶阳性率与受精率、顶体反应率之间都有一定相关性，其相关系数分别为0.5319(P＜0.05）和0.5114 (P＜0.05）。

　　2.2 生育组与不育组的芳香化酶阳性率、受精率、顶体反应率的比较 如表1所示，不育组精子各指标均低于生育组。

　　表1 生育组与不育组精子的芳香化酶阳性率、受精率及顶体反应率（略）

　　与生育组精子相比，*P＜0.01，**P＜0.001
　　
　　图1示：1例不育男性和1例正常男性的精子经间接免疫荧光染色后的流式细胞扫描图，两者芳香化酶阳性率分别为9%和57.7%。

　　图1 1例不育男性和1例正常男性精子芳香化酶表达的流式细胞仪扫描图（略）

　　3 讨论
　　
　　本实验采用流式细胞术证实了精子的芳香化酶阳性率与受精率、顶体反应发生率有相关性，不育组精子芳香化酶阳性率低于生育力正常的男性，提示芳香化酶表达异常可能是造成不育的原因之一。

　　研究表明，雌激素可促进青春期前大鼠睾丸支持细胞的增殖，且与青春期生精过程启动，及精子发生过程和精子细胞的减数分裂后成熟有关［2］。而芳香化酶缺陷可使小鼠精子发生、成熟过程出现异常。芳香化酶基因敲除雄性小鼠生精过程停滞于生精早期阶段，圆形精子细胞、梭形精子细胞减少，圆形精子细胞顶体发育不全，成熟精子运动力降低，且ICSI（intracytoplasmic sperm injection，胞浆内单精子注射）的受精能力下降50%［3］。而芳香化酶抑制剂可便冠毛猕猴的精子发生受到抑制、附睾精子成熟受损［4］。这些结果提示，精子的发生、成熟可能都是雌激素依赖的过程，而芳香化酶缺陷必然导致睾丸中雌激素合成减少。人们先后在人精子中检测到整合素、磷酸二酯酶、钙离子通道亚单位等多种转录产物和蛋白质，认为射出精子中的mRNA可能是精子发生与成熟过程中相应基因转录片段的残留物，其相应的蛋白质既可能是生精过程中睾丸所合成蛋白的残留物，也可能是这些转录片段在精子中的翻译产物［5］。因此精子中的芳香化酶可能是生精细胞在精子发生及成熟过程中的残留物，它在一定程度上反映了睾丸精子发生及成熟过程中生精细胞芳香化酶的水平，其表达异常可能反映了睾丸生精细胞中雌激素生成及其相关生精过程的障碍。
　　
　　此外，作为一个“活动的内分泌单位”，成熟精子中具有生物活性的芳香化酶能够合成雌激素，而后者可对精子功能发生自分泌和/或旁分泌调节作用。早在1994年，Yanagimachi就观察到仓鼠的卵丘细胞可诱发仓鼠精子的顶体反应，而且卵丘细胞及其胞外基质的存在有利于体外受精［6］。由于卵泡细胞是雌性生殖道中雌激素的主要来源，而且卵泡液中含有高水平的E2，人们又对E2进行了进一步的研究，发现E2可以促进仓鼠精子的顶体反应［7］，并能增强大鼠精子的运动力［8］。这些研究结果都说明雌激素对于成熟精子的功能有促进作用。我们推测，精子正是在芳香化酶的作用下合成雌激素，并以自分泌和/或旁分泌方式对精子自身或其它精子的功能产生影响。Lambard等发现在同一份精液标本中，有运动力精子的P450arom mRNA水平高于没有运动力的精子［9］，而E2和睾酮能够增加精子的运动力和迁移率、诱导获能和顶体反应，后者的促进效应能被芳香化酶特异性抑制剂来曲唑所抑制［10］，这些结果都支持了我们的推断，即芳香化酶参与的精子自身雌激素合成与精子的受精过程有关。
　　
　　由此我们推断，精子中芳香化酶的表达水平可间接反映精子发生与成熟过程，同时也可反映射出精子的功能状况。而芳香化酶表达异常一方面可能提示精子发生及成熟障碍而造成的精子结构和功能异常，另一方面也可能提示射出精子中雌激素自分泌和/或旁分泌异常而间接导致的精子功能障碍。

参考文献

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　　［3］ Robertson KM，Simpson ER，Lacham-Kaplan O，et al.Characterization of the fertility of male aromatase knockout mice［J］.J Androl.2001，22(5):825～830.

　　［4］ Shetty G，Krishnamurthy H，Krishnamurthy HN，et al.Effect of long-term treatment with aromatase inhibitor on testicular function of adult male bonnet monkeys (M.radiata)［J］.Steroids，1998，63(7～8):414～420

　　［5］ Goodwin LO，Karabinus DS，Pergolizzi RG，et al.L-type voltage-dependent calcium channel alpha-1C subunit mRNA is present in ejaculated human spermatozoa［J］.Mol Hum Reprod，2000，6(2):127～136.

　　［6］ Yanagimachi R.1994.Mammalian Fertilization.In:The Physiology of Reproduction，E Knobil and J D Neidl (eds)，Raven Press，New York

　　［7］ Bathla H，Guraya SS，Sangha GK.Role of estradiol in the capacitation and acrosome reaction of hamster epididymal spermatozoa in the isolated uterus of mice incubated in vitro［J］.Indian J Physiol Pharmacol，1999，43(2):211～217.

　　［8］ Goeden HM，Zenick H.Influence of the uterine environment on rat sperm motility and swimming speed［J］.J Exp Zool，1985，233(2):247-251.

　　［9］ Lambard S，Galeraud-Denis I，Bouraima H，et al.Expression of aromatase in human ejaculated spermatozoa:a putative marker of motility Molecular Human Reproduction，2003，9:117～124.

　　［10］Aquila S，Sisci D，Gentile M，et al.Towards a physiological role for cytochrome P450 aromatase in ejaculated human sperm［J］.Hum Reprod，2003，18 (8):1650～１６５9．