离子色谱法测定氯膦酸二钠及其制剂的含量和有关物质

【摘要】 采用抑制型电导检测离子色谱法同时测定氯膦酸二钠及其制剂的含量和有关物质。色谱条件为阴离子交换色谱柱(IonPac AS11HC)；检测方式为抑制电导检测；柱温30 ℃；流速1.2 mL/min；以KOH溶液为淋洗液，含量测定采用等度洗脱，有关物质检查采用梯度洗脱。氯膦酸二钠在0.0568～0.1895 g/L范围内线性关系良好(r＝0.9999)； 注射液和胶囊的平均回收率分别为100.1%(RSD=0.7%)和98.9%(RSD=06%)；检出限为0.3 ng。各杂质与主成分色谱峰能完全分离。

【关键词】 离子色谱，氯膦酸二钠

　　Abstract A new ion chromatography was developed for the determination of clodronate disodium and its related substances. A suppressed conductivity detection was used. The analytical column was an IonPac AS11HC anionexchange column. The column temperature was maintained at 30 ℃. The potassium hydroxide solution was used as the eluent at a flow rate of 1.2 mL/min. For the determination of content and related substances，an isocratic elution program and a gradient elution program were performed， respectively．A good linear relationship was observed in the concentration range of clodronate disodium of 0.0568－0.1895 g/L(r=0.9999). The average recoveries of the injection and the capsules were 100.1%(RSD=0.7%) and 98.9%(RSD=0.6%)，respectively. The limit of detection was 0.3 ng. The related substances gained a completely chromatography separation with the principal peak. The present method is accurate， sensitive and simple， which provides a new reliable analytical method for the quality control of clodronate disodium and its preparations.
Keywords Ion chromatography， clodronate disodium

　　1 引 言

　　氯膦酸二钠(clodronate disodium，CD)又名氯屈膦酸二钠，为第一代双膦酸盐类化合物，是近20年发展起来抗代谢性骨病的一类新药。它的分子结构中含有2个膦酸基团，极性强，易电离，不能在反相液相色谱柱上保留；结构中没有发色基团，不能用常规紫外和荧光检测器测定。氯膦酸二钠的分析方法有容量法[1，2]、柱前或柱后衍生离子色谱法[3~6]。国家现行质量标准中，原料和制剂的含量测定均采用容量法，需先破坏氯膦酸二钠结构产生Cl－，再用AgNO3滴定，专属性差且操作复杂[1]。文献[7]和进口药品注册标准[8]用抑制电导型离子色谱法测定氯膦酸二钠注射液的有关物质。例如，进口药品注册标准采用离子色谱法测定氯膦酸二钠注射液的有关物质，但含量测定需柱后衍生后用紫外光谱检测[８]。离子色谱法是普通液相和气相色谱分析离子型药物的重要补充，在药物分析领域的应用不断增多[８~1１]。抑制型电导检测器是一种对水溶液中以离子状态存在的成分具有高灵敏度的通用型检测器。本研究采用抑制电导型离子色谱法，同时测定氯膦酸二钠及其制剂的含量和有关物质(即有机杂质)。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　DIONEX ICS2000离子色谱仪(美国Dionex公司)，配有抑制型电导检测器、EGCKOH淋洗液自动发生装置和ASRS300阴离子自动再生电解抑制器。

　　H3PO3溶液由分析纯试剂配制，H3PO4、Cl－、F－、Br－、SO2－４和NO－3的标准溶液由国家标准物质研究中心基准物配制；水为18.2 MΩ cm超纯水。四水合氯膦酸二钠对照品(进口工作对照品，批号750102034，水分20.0%，含量99.9%)。收集的氯膦酸二钠注射液有3个厂家4批样品，批号为20061101、20070501、060301和74090；胶囊有1个厂家2批样品，批号为Mh3301和MK2301；原料2批，随制剂提供，自编为1#和2#。

　　2.2 色谱条件

　　IonPac AS11HC色谱柱(250 mm×4 mm)；检测器为电导检测器，检测方式为抑制电导检测；柱温30 ℃；流速1.2 mL/min；进样量25 μL，采用淋洗液发生器产生的高纯KOH作为流动相，含量测定采用45 mmol/L KOH等度洗脱。有关物质检测采用梯度淋洗程序：0→20 min， 20→50 mmol/L KOH； 20→24 min， 50 mmol/L KOH； 24→25 min， 50→20 mmol/L KOH； 25→30 min， 20 mmol/L KOH。

　　2.3 氯膦酸二钠的样品制备

　　准确称取氯膦酸二钠对照品适量，用水溶解并稀释制成0.12 g/L对照品溶液。取氯膦酸二钠和氯膦酸二钠注射液适量，分别用水溶解并稀释制成0.12 g/L原料供试品溶液和注射液供试品溶液。准确称取胶囊剂细粉适量(约相当于氯膦酸二钠240 mg)，置100 mL量瓶中，加水适量，超声10 min，放冷，加水稀释至刻度，摇匀过滤，滤液用水稀释制成0.12 g/L胶囊供试品溶液。

　　2.4 有关物质的样品制备

　　准确称取氯膦酸二钠适量，用水溶解并稀释制成1.2 g/L原料供试品溶液；量取注射液适量，用水溶解并稀释制成1.2 g/L注射液供试品溶液。分别准确量取上述供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释制得对照溶液。

　　3 结果与讨论

　　3.1 色谱条件的选择与优化

　　淋洗液在线发生器可获得纯的OH－溶液，与对OH－优化的亲水性分离柱结合后能获得基线变化极小的梯度淋洗系统，有望成为测定离子型药品有关物质的通用分析手段。进口药品注册标准JX20060101采用了复杂的多步曲线梯度洗脱方式测定有关物质，选择两种杂质测定[10]。本实验采用简单的线性梯度洗脱方式(见2.2节)，操作方便，容易重现，主成分与各种杂质分离良好(图1)。氯膦酸二钠原料现行质量标准采用与标准NaCl溶液和磷酸盐溶液比色的方法检查氯化物和磷酸盐，用间接碘量法检查亚磷酸盐，操作过程冗长费时，灵敏度低且有干扰[1]。离子色谱不仅能将杂质与主成分完全分离，而且HPO2－３、PO3－4和Cl－均与其它杂质完全分离，可替代现行质量标准方法，同时测定原料中的氯化物、亚磷酸盐和磷酸盐的含量。

　　在有关物质测定色谱条件基础上，将梯度洗脱改为45 mmol/L KOH溶液的等度洗脱，主峰保留时间约为7.20 min。按照注射液和胶囊处方称取适量空白辅料，配制成供试品溶液。结果显示，辅料不干扰主成分的测定。用水溶液中常见的8种离子（F－、CO2－３、SO2－４、Br－、NO－3和原料中需要控制的Cl－、HPO2－３和PO3－4）与氯膦酸二钠对照品溶液混合后进样分析，氯膦酸二钠与8种阴离子能完全分离(图２)。
　　
　　采用抑制型电导检测器的离子色谱系统比传统液相色谱系统需要更长的平衡时间。如平衡1 d后注射液含量测定的重复性(n=6)和6 h溶液稳定性分别为0.6%和0.8%，平衡2 d后胶囊含量测定对应的重复性和溶液稳定性分别为0.2%和0.3%，优于文献[6]报道的柱后衍生离子色谱法。适当增大抑制器电流可缩短系统的平衡时间。

　　3.2 检出限、溶液的稳定性和强制破坏实验

　　按信噪比为3计算，氯膦酸二钠的检出限约为0.3 ng。取注射液供试品溶液1份，分别在0、17、19、20和23 h后进样，最大杂质含量和总杂质含量均无明显变化，主成分峰面积RSD为0.6%。

　　取注射液5份，处理方式分别为2 mL 0.1 mol/L HCl、2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液、2 mL 3% h3O2溶液、100 ℃加热1 h和3000Lx强光照射1d，考察降解产物与主成分的分离情况。结果显示，溶液状态下的氯膦酸二钠对热和氧化不稳定(图３)，加热和氧化后相对保留时间约0.37 min(保留时间667 min)和017 min (保留时间2.99 min)的杂质含量分别明显增加； 对光、酸和碱相对稳定。固体状态下氯膦酸二钠性质稳定，在105 ℃加热18 h后杂质含量几乎未增加。破坏性实验产生的各种杂质对主成分峰的测定无干扰。

　　3.3 回收率

　　按注射液和胶囊处方，分别精密称取氯膦酸二钠和辅料适量配制成相当于测试浓度80%、100%和120%的溶液，每个浓度配3份，平均回收率分别为100.1%和98.9%，RSD分别为0.7%和0.6%(n=9)。

　　3.4 线性范围、重复性和溶液的稳定性

　　称取氯膦酸二钠对照品适量，用水配制成不同浓度的溶液，分别进样测定。以峰面积A对浓度c进行线性回归，得回归方程为A=50.151c－0.255(r=0.9999， n=5)。表明氯膦酸二钠在0.0568～0.1895 g/L范围内峰面积与浓度呈良好线性关系。取注射液和胶囊供试品溶液各一份，连续进样6次，主成分峰面积RSD分别为0.6%和0.2%；分别连续在6 h内进样，主成分峰面积RSD分别为0.8%和0.3%。

　　3.5 样品测定

　　准确量取适量对照溶液和供试品溶液注入色谱仪，按主成分自身对照法计算最大杂质含量和杂质总含量，结果见表1。氯膦酸二钠在溶液中遇热不稳定，而其注射液一般采用高温湿热灭菌的生产工艺，因此杂质明显增多。

　　准确量取适量对照品溶液和供试品溶液注入色谱仪，按外标法以峰面积计算含量，离子色谱法测定结果与按现行标准测定结果的比较见表1。表中“原方法”指按现行标准检测结果；“本方法”指离子色谱法检测结果。由表１可以看出，离子色谱法与原方法的测定结果基本一致。表1 氯膦酸二钠与有关物质的测定结果（略）

参考文献

　　1 State Food and Drug Administration(国家食品药品监督管理局)．National Drug Specifications(药品注册标准) WS1(X434)2003Z， WS1(X061)2002Z， WS1(X433)2003Z

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　　１１ Wang Xue(王 雪)， Jiao Xiao(焦 霞)， Zhu Yan(朱 岩)． Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2008， 36(3)： 419