基于胸腺嘧啶汞离子胸腺嘧啶结构和纳米金放大传感器检测汞离子

　　　　　　 作者：莫志宏 杨琳玲 杨小超 陈自锋

【摘要】 利用Hg2+与DNA中胸腺嘧啶(T)结合的高度特异性和纳米金在石英晶体微天平(QCM)上的信号放大作用，设计了一种简便灵敏的Hg2+检测方法。纳米金采用柠檬酸钠还原法制备，其表面用末端带巯基的寡核苷酸探针进行自组装修饰，并用6巯基己1醇(MCH)部分取代表面探针，以减少杂交空间位阻。结果表明，寡核苷酸链长为9bp、T个数为7的序列具有较高灵敏度；线性范围为5.0～100 nmol/L；检出限为2.0 nmol/L；Ca2+、Mg2+等其它金属离子无明显干扰。用于环境水样中Hg2+的测定， RSD&<2.9%；加标回收率为97.3%～101.2%。

【关键词】 汞离子，寡核苷酸，纳米金，石英晶体微天平

　　Abstract A simple and sensitive method was developed for the detection of mercury ions with quartz crystal microbalance(QCM)， based on the specific thymine(T)Hg2+T structure and gold nanoparticles. The gold nanoparticles were prepared by the citrate reduction method. In a selfassembled way， the particle surface was modified with the probe oligonucleotides which were partially replaced by 6Mercaptohexan1ol to reduce the steric hindrance of hybridization. The sensitivity was optimized by the oligonucleotide with a strand length of 9bp and a T number of 7. The linear range was 5.0－100 nmol/L with a detection limit of 2.0 nmol/L. And Ca2+， Mg2+ and other metal ions had no significant interferences. This method was successfully applied for the detection of Hg2+in environmental water samples， with RSD less than 2.9% and recoveries of 97.3%－101.2%.

　　Keywords Mercury ion， oligonucleotide， gold nanoparticle， quartz crystal microbalance

　　1 引 言

　　汞对人体健康危害严重[1，2]，是水环境监测的重要指标。环境水样中Hg2+的测定主要采用等离子体原子发射光谱法和质谱法[2，3]、荧光法[4，5]和电化学法[6，7]等。目前，这些方法或需要昂贵的仪器，不适合现场分析；或灵敏度和选择性不能满足环境监测要求，需要进行分离富集，操作繁琐费时。研究发现，Hg2+能介导胸腺嘧啶(T)配对，形成稳定的THg2+T特异性结构[8]；并由此研究了具有良好选择性的Hg2+检测方法，包括荧光猝灭[9]、纳米金凝聚比色[10～13]等。但上述方法的灵敏度还有待进一步提高。石英晶体微天平（QCM）是一种基于压电效应的高灵敏质量传感器（灵敏度可达ng级），装置简单，使用方便，已广泛应用于生物化学传感检测[14]。文献报道采用聚噻吩[15]和黑色素[16]修饰QCM金电极来实现对Hg2+的检测，灵敏度高，但特异性较差。本研究利用Hg2+与T结合的高度特异性和纳米金在QCM上的信号放大作用，如图1所示，设计出富含T的寡核苷酸序列A与B，分别修饰在QCM金电极和纳米金表面；只有当溶液中存在Hg2+时，A与B才能通过Hg2+的介导配对杂交；此时QCM电极表面质量发生明显变化，从而建立了灵敏、特异的检测Hg2+的方法。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　UV2450型紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；TECRAI20型透射式电子显微镜(荷兰Philips公司)；PSC2UD01压电芯片与EXCE100压电传感实时分析仪(重庆大学微系统研究中心)；AA2610 型原子吸收分光光度计(北京华洋光学仪器开发公司) ;汞空心阴极灯(北京真空仪表厂) 。

　　1.00 mmol/L Hg(NO3)2标准溶液；缓冲液为10 mmol/L Nah3PO4Na2HPO4+0.10 mol/L NaNO3（pH 7.4，记为PBN）；Piranha溶液：V（70% h3SO4）∶V（30% h3O2）=3∶1；设计DNA序列（如图3a所示，上海生物工程有限公司）；氯金酸和柠檬酸钠（Amresco公司）；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

　　2.2 纳米金的制备

　　用柠檬酸钠还原法[1７]制备纳米金（NG），将9.72×10－4 mol/L氯金酸水溶液加热至沸腾，加入柠檬酸钠，使其在反应体系中的浓度为4.36×10－3 mol/L，恒温加热搅拌10 min，停止加热继续搅拌至室温。用紫外可见分光光度计扫描所制备纳米金的吸收光谱，最大吸收峰为517.5 nm；用扫描电镜观测纳米金粒径约为（10±1.8）nm，纳米金粒子浓度为32 nmol/L。

　　2.3 QCM金电极表面的寡核苷酸修饰

　　镀金石英晶片在使用前用Piranha溶液清洗5 min，用N2吹干，加入1 μmol/L巯基修饰的寡核苷酸A溶液在室温下自组装12 h，然后用PBN缓冲液清洗。为避免DNA在金电极上自组装时出现相互缠绕或DNA磷酸骨架与金电极的非特异性吸附，采用寡核苷酸A与6巯基己1醇(MCH)摩尔比为1∶10的混合液在QCM金电极表面自组装。

　　2.4 纳米金表面的寡核苷酸修饰

　　取10 nm的纳米金溶液（浓度为32 nmol/L）100 μL，加入与纳米金摩尔比为200:1的巯基修饰的寡核苷酸B溶液，室温反应24 h后，在PBN中室温静置老化48 h，以16000 r/min离心30 min，除去上清液清洗两次后，分散到PBN中；再加入20 μL 0.10 mmol/LMCH溶液，混匀，放置30 min后加入等体积的乙酸乙酯[1８]，使反应终止，离心方法同上，最后分散到100 μL PBN中，纳米金浓度保持在32 nmol/L。MCH起到封闭纳米金表面上的非特异性结合位点和部分取代表面寡核苷酸的作用，以降低纳米金表面寡核苷酸密度、减少空间位阻、提高杂交效率。

　　2.5 Hg2+的检测

　　在QCM检测池中加入380 μL PBN，启动QCM检测平台，开始记录频率，频率（f0）稳定后，分别加入10 μL寡核苷酸修饰纳米金(BNG)和待测Hg2+溶液，观测QCM频率变化（Δf=f－f0），频率稳定后，加入与Hg2+形成更稳定螯合物的半胱氨酸溶液(1 mmol/L)[1９]，进行传感器的再生。Δf与电极表面质量变化成正比，而质量变化取决于QCM电极表面结合的纳米金；据此，Δf与溶液中Hg2+浓度成正比，用于Hg2+的定量检测。检测在室温下进行。

　　３ 结果与讨论

　　3.1 Hg2+介导TT配对的QCM频率响应特性

　　加入Hg2+溶液，QCM频率变化时间关系如图2曲线a所示。曲线b为不含任何金属离子的空白实验。由图2可见，加入BNG后频率几乎没有变化，说明不存在Hg2+时，B没有与A杂交形成双链，并且还没有吸附；加入Hg2+之后，频率下降并最终达到平衡，说明通过碱基T和Hg2+的配位作用，在金电极表面形成了纳米复合物，导致频率大幅下降。频率稳定后，加入半胱氨酸溶液，频率迅速回升，并最终与未加Hg2+时的频率基本重合。这是由于半胱氨酸能与Hg2+形成更稳定的螯合物，从而夺取THg2+T结构中的Hg2+[19]，使纳米复合物分解，将BNG从金电极表面上释放出来，实现了传感器再生。

　　3.2 寡核苷酸链长度与T个数的影响

　　寡核苷酸的链长和T个数对Hg2+检测灵敏度有较大影响。实验设计了5组寡核苷酸序列（见图3a），以考察链长和T个数对Hg2+检测的影响，结果如图3b所示。由图3b可见，对应QCM频率下降程度从大到小的序列依次为2＞3＞4＞1＞5。其原因可能是当DNA链中不含碱基T或所含碱基T过少时（序列1和5），纳米复合物难以形成或不稳定；而含碱基T过多时（序列3）与含碱基T少时（序列2）相比，每个寡核苷酸可结合更多的Hg2+，使灵敏度降低；而全部为碱基T时（序列4），除了纳米金与QCM金电极表面的寡核苷酸配对外，不同纳米金表面的寡核苷酸之间也可能配对，只有部分Hg2+在电极表面形成纳米复合结构，导致灵敏度降低。本实验选择链长为9 bp、含7个T的序列2用于Hg2+检测。

　　对5.0×10－3～2.0 μmol/L浓度范围内的Hg2+溶液进行了测定，结果见图4。随着Hg2+浓度增加，频率下降程度明显增大；但当Hg2+浓度 &> 1.0 μmol/L时，浓度对频率影响不大，说明QCM电极表面纳米复合物基本达到饱和。在5～100 nmol/L范围内，频率变化与浓度呈线性关系，相关系数为0.97，灵敏度为2.8 Hz·L/nmol。以6次空白测量值标准偏差的3倍除以斜率计算得检出限为2.0 nmol/L。

　　3.4 其它离子的干扰和样品分析

　　为考察本方法的选择性，配制了浓度均为0.50 μmol/L的Li+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Co2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+、Fe3+和Hg2+单一组分的标准溶液，实验条件同上，观察QCM频率的变化，结果如表1所示。除了对Pb2+有微弱的响应之外，其它离子均无响应。表明该方法对Hg2+具有良好的选择性。表1 不同金属离子对应的QCM频率响应（略）

　　取某染织厂附近河水，静置过滤除去悬浮颗粒，按实验方法进行测定，并同时测定样品中标准加入回收率，所得结果（见表2）满意。本方法灵敏度高，操作简便， 适用于环境水样中Hg2+的测定。3.5 结论
　　
　　将纳米金和DNA相结合，设计了一种基于纳米金放大的QCM检测方法，实现了对水中Hg2+离子的检测。本方法与荧光法、比色法等相比，灵敏度高，背景干扰小，无需复杂的荧光检测设备。可以通过人工合成能特异结合其它金属离子的碱基，并检测这些金属离子[20]。

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