壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶生物传感器测定葡萄糖的含量

　　　　 作者：张彦 南彩凤 冯丽 张利琴 董川 双少敏

【摘要】 应用壳聚糖将葡萄糖氧化酶固定于鸡蛋膜上，结合氧电极制得葡萄糖传感器。实验表明，壳聚糖比戊二醛能更好地固定葡萄糖氧化酶，最佳条件为壳聚糖浓度0.3%、固定化酶量0.8 mg、 pH 7.0、缓冲溶液浓度300 mmol/L和温度25 ℃。本葡萄糖传感器的线性范围为0.016～1.10 mmol/L；检出限为8.0 μmol/L(S/N=3)， 响应时间&<60 s，有很好的稳定性，寿命&>3个月。同一个传感器重复使用以及同方法制作的不同传感器之间都有很好的重现性，RSD分别为2.5%(n=10)和4.7%(n=4)。实际样品中可能存在的烟酰胺、 VB6、 VB12、 VE、Ca2+、 Mg2+、 K+和Zn2+等对葡萄糖的测定不产生干扰。本传感器已成功地应用于市售饮料中葡萄糖含量的测定。

【关键词】 壳聚糖，葡萄糖氧化酶，葡萄糖，生物传感器，鸡蛋膜

　　Abstract A glucose biosensor was fabricated from a glucose oxidaseimmobilized by chitosan and oxygen electrode. The effects of concentration of chitosan(0.3%)， enzyme loading(0.8 mg)， pH 7.0， phosphate buffer concentration(300 mmol/L)， and temperature 25 ℃ for the response of the biosensor were investigated. The glucose biosensor has a linear response range of 0.016－1.10 mmol/L with a detection limit of 8.0 μmol/L(S/N=3). The response time was less than 60 s. The biosensor showed extremely good stability with a shelflife of at least 3 months. The biosensor exhibited good repeatable response to a 0.25 mmol/L glucose solution with a relative standard deviation of 2.5%(n=10). The precision of fabrication of the biosensors using four different membranes was good with a RSD of 4.7%. Some common potential components in sample such as niacinamide， vitamin B6， vitamin B12， vitamin E， Ca2+， Mg2+， K+ and Zn2+ showed no interferences on the response of the glucose biosensor. The biosensor was successfully applied to determine the glucose in commercial beverage samples.

　　Keywords Chitosan， glucose oxidase， glucose， biosensor， eggshell membrane

　　1 引 言

　　葡萄糖是动植物体内碳水化合物的主要组成部分，其定量测定在食品分析中占有很重要的位置。到目前为止，测定葡萄糖的方法主要有分光光度法[1]、电流测定法[2]、高效液相色谱法[3]、极谱法[4]及毛细管电泳法[5]等，但是这些方法分析速度慢或成本太高。生物传感器克服了这些缺点颇引人注目，酶的固定化与载体的选择影响生物传感器的灵敏度、稳定性等。文献已报道固定化葡萄糖氧化酶的多种方法: 共价交联固定到铂纳米颗粒修饰的直立碳纳米管电极上[6]、包埋法固定于NiO纳米球上及溶胶凝胶法固定于壳聚糖/SiO2杂化材料中等[7，8]， 但是这些方法复杂或稳定性差。鸡蛋膜为角质蛋白纤维交织成的网状结构，是天然的有机膜材料，具有良好的透水透气性及较好的机械性能，能选择性地通过乙酸、水等小分子，可作为生物传感器中酶固定化的优良载体。已有报道以戊二醛为交联剂将酶固定于鸡蛋膜上制得葡萄糖传感器[9]，但是戊二醛含有细胞毒素[10]，会使酶部分失活。而壳聚糖是生物有机高分子化合物，具有良好的成膜性、吸附使用、无毒及生物相容性好等优点，可应用于生物传感器的构建[11]。

　　本研究应用壳聚糖包埋法将葡萄糖氧化酶固定于鸡蛋膜上，并结合氧电极制得葡萄糖生物传感器。

　　葡萄糖（Glucose）+O2葡萄糖氧化酶Glucose oxidase葡萄糖酸（Gluconic acid）+2h3O2(1)
反应中氧气消耗量能被氧电极捕捉并转化为电信号，根据反应中消耗的氧气与葡萄糖的浓度成正比的关系，建立了测定葡萄糖含量的方法。本传感器操作简单，成本低，具有灵敏度高、响应时间短、选择性高和稳定性好等优点，并应用于市售饮料中葡萄糖含量的测定。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　Pasco CI6542溶解氧传感器（Pasco Scientific，Roseville，CA）; pHS3C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）; 812型恒温磁力搅拌器（上海凯欣仪器厂）。葡萄糖氧化酶（Sigma公司，酶活力为234900 Units/g）， βD葡萄糖（Acros Organics公司），壳聚糖（Sigma公司，脱乙酰度75%～85%）； Na2HPO4Nah3PO4缓冲溶液(PBS)。其它试剂均为分析纯。实验用水为石英亚沸二次蒸馏水。

　　2.2 酶电极的制备

　　0.06 g壳聚糖溶解于10 mL 0.05 mol/L HCl（80～90 ℃）中，用0.1 mol/L NaOH调节pH至5.7，用水定容至20 mL，过滤得0.3%壳聚糖溶液。向直径15～20 mm干净的鸡蛋壳膜滴加适量0.8 （w/V）葡萄糖氧化酶溶液，2 h后滴加100 μL 0.3%壳聚糖溶液，放置6 h后用PBS(0.05 mol/L)反复冲洗。将固定化膜紧贴于氧电极顶端并用“O”型环固定，即成酶电极，浸泡于PBS缓冲液（pH 7.0）中，4 ℃存放，待用。

　　2.3 实验方法

　　将制备好的酶电极浸入5 mL被空气饱和的PBS缓冲液中，均匀搅拌下加入不同体积的葡萄糖标准溶液或者待测溶液，溶解氧信号被氧电极捕捉后，电极电位的变化被输入计算机数据处理器中，并以溶解氧浓度变化的形式输出，记录溶解氧浓度下降曲线，用校正曲线法检测样品中葡萄糖含量。

　　3 结果与讨论

　　3.1 不同固定化方法的比较

　　葡萄糖浓度的连续改变在本传感器上产生典型的响应曲线，如图1所示。葡萄糖浓度x(mmol/L)和溶解氧浓度下降值y（mg/L）之间的线性关系为y=6.7471x－0.00501(r=0.9989)。

　　将本实验制得的传感器与以戊二醛为交联剂制作的生物传感器进行了比较（如图2）。结果表明： 前者响应值是后者的1.63倍，而且前者的响应时间较短，与文献[13]报道一致。

　　3.２ 葡萄糖检测条件的最优化

　　３．２．１ 壳聚糖溶液浓度对传感器响应的影响

　　壳聚糖的等电点是6.3[13]，当pH&<6.3时，壳聚糖上的氨基质子化而带正电荷。葡萄糖氧化酶的等电点是4.2[14]， 当pH&>4.2时，葡萄糖氧化酶带负电荷。在pH=4.2～6.3的溶液中，壳聚糖与葡萄糖氧化酶可形成稳定的离子对，且壳聚糖有良好的成膜性，所以壳聚糖能够使酶很好地固定于鸡蛋壳膜上。壳聚糖的浓度会影响酶的固定化程度，导致传感器响应的差异。用浓度分别为0.1％、 0.2％、 0.3％、 0.4%(w/Ｖ)的壳聚糖溶液与氧电极结合制成4种葡萄糖传感器。考察壳聚糖溶液浓度对传感器响应的影响， 结果表明，当壳聚糖溶液浓度是0.3%时，传感器的响应值最高且稳定; 当其浓度&<0.3%时，平行测得4次的响应值逐渐减小。第４次测定时几乎没有响应，可能是因为壳聚糖浓度太小，不能很好的固定葡萄糖氧化酶，导致酶逐渐泄露； 当壳聚糖的浓度&>0.3%时，传感器的响应值下降，且响应时间延长，可能是过高浓度的壳聚糖对酶的催化作用产生了阻碍作用。所以本实验选用0.3%壳聚糖溶液来固定葡萄糖氧化酶。

　　3.２．２ 固定化酶量的影响

　　酶反应速率很大程度上决定于酶的活性，所以固定化酶量将影响生物传感器的灵敏度。在鸡蛋膜上分别滴加含酶量为0.2、0.6、0.8、1.2、1.4 mg的酶溶液制得一系列葡萄糖传感器。考察固定化酶量对传感器响应的影响。酶用量为0.2～0.8 mg时，响应值随着酶用量的增加而急剧增大。当酶用量大于0.8 mg时，响应增大值趋于平缓。因此，本实验选用0.8 mg葡萄糖氧化酶。

　　3.２．３ pH的影响

　　分别在5 mL浓度为300 mmol/L pH=3.0～10.0 PBS中各注入25 μL 0.05 mol/L葡萄糖标准溶液，考察缓冲溶液pH值对本传感器响应的影响。pH在6.0～8.0之间时，溶解氧浓度下降值基本稳定，但当pH&<6.0或&>8.0时，响应值明显降低。过酸或过碱的底液破坏了酶的结构而使之活性降低，从而导致传感器灵敏度下降。故选用pH=7.0的PBS。

　　3.２．４ 离子强度的影响

　　分别在5 mL浓度为25、50、100、200、300、400和500 mmol/L的PBS（pH=7.0）中，加入25 μL 0.05 mol/L葡萄糖标准溶液，考察离子强度对葡萄糖传感器响应的影响。随着离子强度的增加，溶解氧浓度下降值逐渐增大。但是当缓冲液的浓度&>300 mmol/L时，传感器的响应时间明显增长，所以选用300 mmol/L PBS。

　　3.２．５ 温度的影响

　　控制温度分别为10、20、30、40和50 ℃，考察温度对该葡萄糖传感器的影响。随着温度的升高，溶解氧浓度下降值逐渐增大。考虑到在高温条件下酶容易失活，所以本实验选用温度为25 ℃。

　　3.２．６ 响应时间

　　响应时间为将传感器置于一个已知浓度的标准溶液中的响应信号达到稳定值的95%以上所用的时间[15]。在300 mmol/L（pH=7.0）PBS中测定0.05 mmol/L 葡萄糖标准溶液，记录从加样到溶解氧浓度值达到稳定值95%时的时间，得平均响应时间为60 s。

　　3.３ 线性范围、检出限和重现性

　　本葡萄糖传感器在葡萄糖浓度０．０16～1.10 mmol/L间呈现良好的线性关系，线性回归方程为y(mg/L)=6.7471x(mmol/L)－0.00501(r=0.9989)； 以３倍空白的标准偏差除以标准工作曲线的斜率计算传感器的检出限为8 μmol/L。由同一张酶膜制成的传感器对0.25 ｍmol/L葡萄糖溶液重复测定10次，响应平均值RSD=2.5%。将不同的固定化酶膜分别置于氧电极表面制得4个葡萄糖生物传感器，对0.25 mmol/L葡萄糖溶液进行测定，RSD=4.７%。

　　3.４ 传感器的寿命

　　本葡萄糖生物传感器存放于4 ℃冰箱中，每隔3～4 d重复检测。0.25 mmol/L葡萄糖溶液的响应值。3个月后响应信号为初始值的86.5%； 对该浓度葡萄糖连续测试200次（约24 h），响应信号仍能达到初始值的98%以上。

　　3.５ 葡萄糖传感器的干扰实验

　　在实际样品测定时，一些葡萄糖共存物可能会对测定产生影响。本实验对可能产生干扰的物质如：烟酰胺、VB6、VB12、VE、Ca2+、Mg2+、K+、Zn2+等，进行了干扰测试。将这些导致氧气浓度的下降值换算葡萄糖浓度的当量。结果如表1所示， 这些物质对葡萄糖的测定几乎不产生干扰。表1 干扰实验（略）

　　3.６ 实际样品的测定

　　取3瓶摇匀的某品牌营养饮料作为待测的实际样品，按上述方法进行测定，并在以上3份实际样品中分别加入10.0 mmol/L葡萄糖标准溶液，进行回收率测定。如表2所示，本方法的回收率为9８％～表2 实际样品分析及回收率实验结果(略)

　　这说明本方法构建的葡萄糖生物传感器为葡萄糖含量的测定提供了一种精确的方法。

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