无筛板型固相萃取柱的制备及其在食品中苯甲酸的测定研究

　　　　 作者：宋文青 刘亚雄 王琴 包建民

【摘要】 结合固相萃取(SPE)盘与含支撑物的SPE柱技术，制备了一种新型的无筛板型固相萃取柱。以C18填料为例，以话梅样品为介质对其中的苯甲酸进行分析，并用传统固相萃取小柱平行比较;将SPE与HPLCUV结合，考察了填料对简单介质中苯甲酸的最大吸附量及洗脱曲线，研究了新型SPE柱在实际应用中的分离纯化效果。结果表明，新型SPE柱对样品的吸附效果更好，规格为200 mg/3 mL的SPE柱对苯甲酸的吸附量达到0.951 mg，超过了传统柱的吸附量0.908 mg;其洗脱曲线与传统柱几乎重合;苯甲酸在1～100 mg/L浓度范围内线性关系良好， r=0.9999，用此SPE柱纯化后的样品加标回收率和相对误差分别在88.4%～102.3%和1.4%～2.9%之间。

【关键词】 固相萃取柱，筛板，填料，苯甲酸

　　 1 引 言

　　固相萃取(SPE)是一种试样预处理技术，由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来[1]。作为液体试样制备方法，SPE优于传统的液液萃取法(LLE)，如无乳化现象;不需要使用超纯溶剂，有机溶剂消耗低，对环境污染小;适用于小体积试样;处理样品速率快，尤其适于处理挥发性及对热不稳定药物[2，3]。

　　SPE柱是SPE最普通的使用形式，一般的SPE柱是在类似于注射筒的塑料或玻璃柱管中填装适量的填料，上下各加一片聚乙烯筛板为支撑体[4]。这种筛板在使用中会产生诸如非特异性吸附和通道效应等问题，影响了萃取效率。SPE盘是SPE的另一种形式。它是通过选择性质稳定、粘合性好的特定的固化剂，将其与SPE吸附剂相互混合，用特殊的工艺压制成坚固的圆片。由于吸附剂被固化剂紧密地粘合在一起，减少了吸附剂之间的死体积，在萃取时无通道效应，因而萃取效率得到提高[5，6]。这种盘片一般适用于处理较大体积的液体，但是由于该膜片无支撑体，使用范围受到了限制。

　　本研究在现有SPE盘技术的基础上，将另一种含支撑体系的SPE柱技术的思想与之结合，把填料和支撑物用粘合剂进行固化，制得一种新型整体性填料。利用此填料开发了一种全新的无筛板SPE小柱并对其各项性能和指标进行了系统的评价。

　　苯甲酸作为常用的防腐剂广泛存在于食品中，国家对其使用有严格的限量标准，过量使用会对人体产生危害，因而对存在于食品中的苯甲酸的检测是非常必要的[7，8]。本研究选取存在于不同介质中的苯甲酸作为样品，评价了此种新型 SPE 小柱的色谱能力。无筛板SPE的最大优势表现为：无需多孔筛板的支撑，避免了筛板的非特异性吸附，提高了分离效率和回收率;所利用的惰性材料减少了SPE上样过程中的多通道沟流效应，提高了分离效率和载样量; 适用于比常规SPE填料小得多的超细填料。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　XL30环境扫描电镜(Philips公司); 1100高效液相色谱仪(安捷伦公司);QT6150超声机(天津市瑞普电子仪器公司);5415c离心机(Eppendorf Centrifuge);传统和新型的SPE小柱均由天津奥秘科技有限公司提供。

　　苯甲酸(99%，天津一方科技有限公司);乙酸铵、甲苯、丙酮、二氯甲烷均为分析纯，甲醇为色谱纯(天津大学科威公司);水为去离子水;九制话梅由商店购得。

　　2.2 色谱条件

　　FujiC18色谱柱(150 mm×4.6 mm， 5 μm，天津市三维色谱仪器配件厂);流动相：V(甲醇)∶V(0.02 mol/L乙酸铵)=10∶90;流速：0.8 mL/min;检测波长：230 nm;进样量：20 μL。

　　2.3 实验方法

　　2.3.1 碳十八烷基填料的键合[9] 取硅胶10.0 g，用6 mol/L HCl进行酸洗后，抽吸过滤，蒸馏水洗至洗出液呈中性，烘干。将处理好的硅胶放入三口烧瓶中，固定在油浴上，右侧接滴液漏斗，内装十八烷基三氯硅烷13.6 mL和甲苯20.0 mL，漏斗上端封闭，左侧接真空泵。开启真空泵抽真空2 h，使油浴温度控制在150 ℃。加热完毕后，待油浴温度降至50 ℃左右，关闭真空泵，边搅拌边缓慢加入硅烷化试剂和甲苯混合液，右侧加入0.5 mL三乙胺后，左侧立刻通入N2，右侧连接冷凝装置，启动加热开关，控制反应液温度130 ℃，连续回流反应3 h。冷却至室温。抽滤，依次以甲苯、甲醇、二氯甲烷洗涤硅胶2次，最后用丙酮洗涤抽滤，将硅胶放入电热真空干燥箱(80 ℃，0.04 MPa，3 h)，冷却至室温即得产品。

　　2.3.2 新型填料的制备及表征 取适量C18填料，依照不同产品性能的要求调整不同比例(如20%～30%)结构性添加物的复合粘合剂，在充分混匀后，加压成型，即可得此具有整体性的填料。将两种填料彻底干燥后进行电镜扫描，可看出表面结构的差异，放大倍数为100倍。

　　2.3.3 填装 传统固相萃取是时将填料装填在两个挡板之间，而新型固化填料无需挡板，直接装填压匀即可使用。每种小柱都分别装有200 mg/3 mL，500 mg/6 mL两种规格。

　　2.3.4 苯甲酸的吸附测定 以0.02 mol/L 乙酸铵水溶液为溶剂，分别配制1.0和2.0 g/L的苯甲酸溶液。取1.0 g/L样品溶液1 mL 通过已用3 mL 甲醇和3 mL 水清洗活化了的规格为200 mg/3 mL的SPE柱，3 mL甲醇洗脱，流速1 mL/min，结合 HPLC按外标法测定洗脱液中苯甲酸的含量;再分别取2.0 g/L样品溶液1 mL 通过已活化的规格为500 mg/6 mL 的SPE柱，5 mL甲醇洗脱1.0 g/L苯甲酸溶液，同法进行定量测定。比较两种SPE柱对苯甲酸的吸附值。

　　取1.0 g/L苯甲酸溶液1.0，1.2，1.4，1.6，1.7及1.8 mL，分别通过已活化的规格为200 mg/3 mL的SPE柱，3 mL甲醇洗脱，流速为1 mL/min;另取2.0，3.0，4.0，4.5，4.8和5.0 mL的1.0 g/L苯甲酸溶液，分别通过已活化的规格为500 mg/6 mL的SPE柱，5 mL甲醇洗脱，流速为1 mL/min，同法进行定量测定，计算出两种SPE 小柱对苯甲酸的最大吸附值。

　　以0.02 mol/L 乙酸铵水溶液为溶剂，配制200 mg/L 苯甲酸样品溶液。取1 mL分别通过两种已活化的SPE柱(200 mg/3 mL)，再依次用水、10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%及100%甲醇水溶液洗脱，洗脱液体积为3 mL，流速为1 mL/min，HPLC定量测定，计算出两种SPE小柱的累积洗脱量。

　　2.3.5 复杂介质中苯甲酸含量的测定 配制浓度为1.0，5.0，25.0，50.0和100.0 mg/L 苯甲酸标准溶液。经0.45 μm 滤膜过滤后分别取20 μL 注入色谱仪，测定峰面积，以峰面积对浓度作曲线。取10.0 g话梅肉于50 mL 小烧杯中，加去离子水25 mL，超声提取10 min，4000 r/min离心10 min，取上清液，去离子水定容至30 mL [10]。分别取上述溶液2 mL通过已活化的规格为500 mg/6 mL的两种SPE柱，用5 mL 70%甲醇水溶液以1 mL/min流速分析洗脱，收集洗脱液，经0.45 μm 滤膜过滤后，待测。

　　3 结果与讨论

　　3.1 填料的表征

　　由图1可见，传统C18填料颗粒之间具有一定的空隙(图1a);而添加了粘合剂的C18填料(固化后)颗粒紧密地聚集在一起(图1b)，上样以后避免了多通道沟流的形成。

　　3.2 简单介质中苯甲酸的测定

　　3.2.1 填料对苯甲酸吸附能力的测定 以苯甲酸为分析物，乙酸铵水溶液为溶剂，考察了不同规格SPE小柱对不同浓度样品的吸附，每个规格4个柱子平行测试(柱规格为200 mg/3 mL)。结果显示，添加了粘合剂的新型SPE小柱对苯甲酸的平均吸附量为0.951 mg， 优于传统的SPE小柱平均吸附量0.908 mg。

　　当流出液中样品含量超过加入量的10%时，通常视为小柱达到最大吸附量。考察了新型SPE 小柱与传统SPE小柱对苯甲酸的最大吸附量，结果见图2。两种规格的新型SPE柱的吸附量均较传统柱略高。

　　3.2.2 洗脱曲线的测定 如图3所示，随着甲醇比例的增加，洗脱率逐渐提高，以3 mL 40%甲醇水溶液基本可以将苯甲酸完全洗脱。两种类型的SPE小柱在同时经历不同洗脱液条件直接对比下，对于苯甲酸的吸附几乎是相同的，表明新型SPE小柱的色谱性能未受影响。

　　3.3 复杂介质中苯甲酸的测定

　　苯甲酸在1～100 mg/L范围内线性关系良好，其回归方程为Y=87.229X(mg/L)-7.503，相关系数r=0.9999。

　　1. 新型SPE (Novel SPE); 2. 传统SPE (Traditional SPE)。通过比较未经SPE小柱预处理话梅样品的HPLC 谱图以及分别用两种SPE 小柱纯化了的样品HPLC谱图来评价新型SPE 小柱对于预处理复杂样品的能力(见图4)。新型SPE小柱的分离纯化效果更好，测得话梅中苯甲酸含量3.05 mg/L(见表1)。

　　图4 未经SPE柱纯化的样品溶液(a)，经新型SPE柱纯化的样品溶液(b)和经传统SPE柱纯化的样品溶液(c)的HPLC谱图

　　Fig.4 Chromatogram of sample without purification(a)， sample purificated with novel SPE(b) and sample purificated with traditional SPE(c)表1 经不同种SPE纯化后所得色谱图峰面积

　　3.4 方法精密度与加标回收率

　　选用待测话梅样品，分别加入0.1，0.5和1.0 g/kg的苯甲酸标准溶液，按照2.3.5节的方法处理样品。每个浓度水平测定5次，分别计算其方法的精密度及加标样品的平均回收率(n=5)，将新型SPE柱与传统SPE柱比较(SPE柱规格为500 mg/6 mL)，结果见表2。经新型SPE柱纯化的样品的添加回收率在88.4%～102.3%之间，RSD值小于2.9%。结果表明，所制备新型 SPE 柱具有较好的分离纯化能力。表2 方法精密度与回收率

参考文献

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