污染肝素中多硫酸化硫酸软骨素的分步醋酸纤维素薄膜电泳分析

　　　　 作者：王皓 于广利 赵峡 郝翠 胡艳南 殷秀红

【摘要】 采用离子交换色谱法从污染肝素原料中分离出多硫酸化硫酸软骨素(OSCS)，建立了分步醋酸纤维素薄膜电泳法分析污染肝素中OSCS含量的方法。结果表明，先以0.05 mol/L醋酸钡缓冲液(pH 5.0)电泳，再以0.15 mol/L醋酸锌缓冲液(pH 6.3)电泳，可以将肝素和OSCS完全分开，检出限为0.1 g/L; 通过灰度积分建立定量校准曲线，相关系数为0.9934，平均回收率为102.1%～106.1%; RSD为4.1%～6.0%。

【关键词】 肝素，硫酸软骨素，醋酸纤维素薄膜电泳

　　1 引 言

　　肝素(heparin，HP)作为抗凝剂在临床中广泛应用[1，2]，其常见的不良反应仅为出血或血小板减少。2008年初，美国临床应用的HP注射剂发生了较严重的过敏反应，推测可能与HP原料中含有多硫酸化硫酸软骨素(oversulfated chondroitin sulfate，OSCS)有关[3]，但缺乏足够的证据。为了加强该类原料质量监督，建立一种快速有效的检测HP中OSCS的方法十分必要。目前，检测HP的常用方法主要有生物学方法[4]、分光光度法[5，6]、光散射法[7]、电化学分析法[8]、HPLC法[9]以及毛细管电泳法[10]等。但由于OSCS和HP结构十分相似，常规的生物学方法难以对其进行检测，而毛细管电泳(CE)和核磁共振(NMR)等方法[3，11]虽然可以用于OSCS检测，但存在设备昂贵、分析时间长以及操作复杂等缺点。

　　本研究采用离子交换色谱法从污染的肝素钠原料(contaminated heparin，CHP)中分离得到OSCS，并通过1HNMR确证了其结构。在分析比较了不同缓冲液体系中OSCS醋酸纤维素薄膜电泳行为的基础上，建立了醋酸钡醋酸锌分步电泳法。本方法可将OSCS与HP和其它糖胺聚糖有效分离，并可对OSCS进行定量分析，达到了快速检测HP中杂质的目的。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　AKTA FPLC快速蛋白纯化系统(美国GE公司);Elx 808酶标仪(美国BioTek公司);3000 xi电泳仪(美国BioRad公司);DYCP38B卧式水平电泳槽及WD9404超级加样器(北京六一公司);BIOCAPT200M凝胶采集系统(美国SIM公司);GelPro Analyzer软件(美国Media Cybernetics公司);Jeol JNM ECP 600 MHz超导核磁共振波谱仪(日本电子株式会社)。

　　透明质酸(HA，来源于链霉菌)、硫酸软骨素A(CSA，来源于牛气管)、硫酸软骨素C(CSC，来源于鲨鱼软骨)、硫酸皮肤素(DS，来源于猪肠粘膜)、硫酸乙酰肝素(HS，来源于牛肾脏)、肝素(HP，来源于猪肠粘膜)等糖胺聚糖标准品购自美国Sigma公司;Sephadex G10凝胶(Super fine，瑞典Pharmacia Biotech公司);Q Sepharose Fast Flow凝胶(美国GE公司);醋酸纤维素薄膜(硬膜，9 cm×7 cm，北京六一公司);其它试剂均为分析纯;所用水均经Millipore纯水仪过滤。

　　2.2 污染肝素中多硫酸软骨素的分离纯化

　　采用Q Sepharose Fast Flow(XK 12 cm×1.0 cm， i.d.)离子交换柱分别对HP标准品、CHP进行分离，依次以双蒸水和0.4， 0.6， 0.8， 1.2和2.0 mol/L NaCl进行梯度洗脱，每个梯度各洗脱2 倍柱体积，分部收集(2 mL/管)并用硫酸咔唑法[12]逐管检测，合并收集含糖组分，经Sephadex G10脱盐后冷冻干燥，备用。

　　2.3 1HNMR对杂质成分的分析[13]

　　将30 mg HP标准品及分离所得杂质以0.5 mL重水溶解，冻干，重复3次，以0.5 mL重水溶解，以0.5% 2，2二甲基2硅戊基5磺酸钠(DSS)为内标，在25 ℃采用核磁共振波谱仪测定。

　　2.4 电泳方法

　　电泳缓冲液1为0.05 mol/L醋酸钡(pH 5.0);电泳缓冲液2为0.15 mol/L醋酸锌(pH 6.3);电泳缓冲液3为0.1 mol/L吡啶0.47 mol/L甲酸(pH 3.0)。

　　将醋酸纤维素薄膜用50%甲醇溶液浸泡过夜，电泳前用滤纸吸去其表面的甲醇溶液，置于电泳缓冲液中浸泡约20 min。用滤纸吸去薄膜表面的电泳缓冲液，分别吸取10 μL标准品和样品溶液于超级加样器孔中，用加样器点样(0.5 μL)，置于电泳槽中平衡10 min。分别采用醋酸钡、醋酸锌和吡啶甲酸3种电泳缓冲液，在如下条件进行电泳：0.05 mol/L醋酸钡(pH 5.0)，电流6 mA，电泳时间35 min;0.15 mol/L醋酸锌(pH 6.3)，电流8 mA，电泳时间35 min;0.1 mol/L吡啶0.47 mol/L甲酸(pH 3.0)，电流7 mA，电泳时间20 min。电泳结束后用0.5%(w/V)阿利新蓝染色约20 min，再以2%醋酸溶液脱色至本底为白色。

　　2.5 实验方法

　　分别取OSCS和CHP适量，将OSCS依次配制成0.1， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 3.0， 4.0和5.0 g/L水溶液，CHP配制成5.0 g/L水溶液，按上述方法进行电泳。

　　电泳结束后将所有电泳条带采用GelPro Analyzer凝胶定量分析软件进行灰度积分，建立OSCS的浓度灰度积分值关系曲线，并且按照该曲线计算CHP中OSCS的含量。

　　3 结果与讨论

　　3.1 HP标准品和CHP的离子交换色谱分析

　　由于HP和OSCS均带有负电荷，并且其电荷密度不同，可以通过阴离子交换色谱，以逐渐增大的离子强度将HP和OSCS分离。HP标准品和CHP在Q Sepharose Fast Flow离子交换柱的NaCl梯度洗脱曲线见图1。

　　(■) 肝素(HP); (﹡) 污染肝素(CHP); (-) NaCl.由图1可见，HP标准品在0.8 mol/L和1.2 mol/L NaCl两个梯度中各洗脱出一个峰，后一个峰所占比例较大;在2.0 mol/L处未见有糖峰。CHP在0.8 mol/L和1.2 mol/L NaCl处洗脱曲线与HP标准品相似，但是在2.0 mol/L处则有一个新峰出现，将此峰标记为CHP3。通过与HP的洗脱曲线比较，认定CHP3峰为CHP中的杂质成分。为了进一步对杂质进行结构分析，采用Q Sepharose Fast Flow 柱(20 cm×2.6 cm)为制备柱对杂质进行分离，收集2.0 mol/L NaCl洗脱出的组分，浓缩后以Sephadex G10柱(95 cm×2.6 cm)脱盐，冻干。对CHP3的单糖组成分析表明，其含有大量氨基半乳糖和葡萄糖醛酸，符合硫酸软骨素类物质的单糖组成特征;同时1HNMR的研究也表明其含有氨基半乳糖，通常HP中乙酰氨基葡萄糖的甲基氢信号在2.03，而OSCS中乙酰氨基半乳糖甲基氢信号在2.12～2.15。通过与HP标准品比较并结合文献[3，11]，CHP3在2.13有强信号，表明其为OSCS。 图2 CHP3(a)与HP(b)的1HNMR图谱

　　3.2 醋酸纤维素薄膜电泳法检测HP中OSCS

　　采用醋酸钡[14]、醋酸锌[15]、吡啶甲酸[16]3种电泳缓冲体系进行醋酸纤维素薄膜电泳分析，并对缓冲液离子强度、电流大小、电泳时间进行优化，其最佳电泳条件分别为：0.05 mol/L醋酸钡(pH 5.0)，电流6 mA，电泳时间35 min;0.15 mol/L醋酸锌(pH 6.3)，电流8 mA，电泳时间35 min;0.1 mol/L吡啶0.47 mol/L甲酸(pH 3.0)，电流7 mA，电泳时间20 min。CHP和HP等糖胺聚糖标准品在3种优化后电泳条件下的电泳图见图3。

　　由图3可见，在Ba(Ac)2缓冲液中(图3a)，HP和CHP均分成了两条带，一条与HS迁移率相似，另一条则分布在点样处，而OSCS则几乎全部分布在原点;此外， HP在原点的条带颜色很浅，但CHP的条带颜色比HP深许多。在Zn(Ac)2缓冲液(图3b)中，CHP未能分成界线清晰的两条带，但是同HP和OSCS相比，在HP的下沿处多出了一条和OSCS相似的条带。在吡啶甲酸缓冲液中(图3c)，CHP也未能分成界线清晰的两条带，而且在HP的上沿处可见到一条与OSCS相似的条带。上述结果表明，在对传统电泳方法优化的条件下，虽然能将6种糖胺聚糖进行分离，但均不能实现HP与OSCS完全分离。在对类肝素样品的分步电泳研究中，邓岗等[17]采用分步电泳法分离尿液中海洋硫酸多糖，即先用0.1 mol/L Zn(Ac)2缓冲溶液(pH 6.0)，再用1.0 mol/L Ba(Ac)2缓冲溶液(pH 5.0)分离，但该方法同样不能将HP和OSCS进行分离。

　　a. 0.05 mol/L Ba(Ac)2(pH 5.0)， 6 mA， 35 min; b. 0.15 mol/L Zn(Ac)2(pH 6.3)， 8 mA， 35 min; c. 0.1 mol/L pyridine0.47 mol/L formic acid(pH 3.0)， 7 mA， 20 min; d. 0.05 mol/L Ba(Ac)2， 6 mA， 2 min then 0.15 mol/L Zn(Ac)2， 8 mA， 30 min。1. 透明质酸(hyaluronic acid， HA);2.硫酸乙酰肝素(heparan sulfate， HS);3.硫酸皮肤素(dermatan sulfate， DS);4.硫酸软骨素A(chondroitin sulfate， CSA);5.硫酸软骨素C(chondroitin sulfate， CSC);6. 肝素(heparin， HP);7. 污染肝素(contaminated heparin， CHP);8. 多硫酸化硫酸软骨素(oversulfated chondroitin sulfate， OSCS).本研究尝试了上述各种电泳体系的分步电泳条件，最终确定了将HP与OSCS有效分离的分步电泳条件： 首先以Ba(Ac)2缓冲液浸泡醋酸纤维素薄膜20 min，点样后平衡5 min，并在该电泳缓冲液中电泳2 min;然后将膜取出，更换为Zn(Ac)2缓冲液并平衡5 min，电泳30 min。在此分步电泳条件下，CHP分成了3条清晰的条带(图3d)，其中有2条与HP一致，而最下方的条带与OSCS一致，实现了OSCS与HP完全的分离。

　　3.3 OSCS醋酸纤维素薄膜电泳灰度积分曲线的建立

　　为了对CHP中OSCS进行定量分析，本研究采用灰度积分的方法对不同浓度OSCS(0.05， 0.1， 0.5， 1.0， 2.0， 3.0， 4.0和5.0 g/L)的灰度值和含量线性关系进行了测定。将不同浓度OSCS按上述分步电泳方法进行电泳，电泳结束后将所有电泳条带采用GelPro Analyzer凝胶定量分析软件进行灰度积分，以OSCS浓度(X，g/L)与灰度值(Y)作图。结果发现，OSCS的醋酸纤维素薄膜电泳检出限为0.1 g/L; 线性分析范围为0.1～5.0 g/L。研究还发现，不同的浓度范围应建立不同的校准曲线。OSCS在0.1～1.0 g/L范围内线性方程和相关系数为Y=207.61X-12.354和r=0.9934，而在1.0～5.0 g/L范围内线性方程和相关系数为Y=779.97X-689.01和r=0.9917。

　　3.4 OSCS回收率和精密度的测定

　　配制浓度为0.50， 0.70， 1.60和2.20 g/L OSCS水溶液，按上述分步电泳方法进行电泳和灰度积分，平行操作5次。根据其灰度值来确定选用的线性方程，然后以相应的线性方程计算回收率和精密度(表1)。表1 回收率及精密度实验结果(n=5)

　　Sample No.A1A2A3B1B2B3C1C2浓度 Concentration(g/L)-1.411.12---0.411.00含量 Percentage(%)-28.222.4---8.220.0 “-”未检出(not detected)。由表1可见，不同浓度OSCS的回收率在102.1%～106.1%之间; RSD为4.1%～6.0%。其回收率和精密度较好，可用于常规OSCS定性与定量分析。

　　3.5 污染样品中OSCS的检测

　　将来自不同厂家的8批HP原料和OSCS标准品分别配成5.0和4.0 g/L水溶液，按上述电泳方法进行电泳和灰度积分，以外标法定量，每个样品平行测3次，结果见表2。从表2可见，有4批样品检测到OSCS，其含量为8%～28%，其中厂家A的2批样品和厂家C的两批样品均检出了较高的OSCS，尤其A2中OSCS含量高达28%;而厂家B的3批样品均未检出OSCS，表明其质量较好。

　　综上可见，醋酸纤维素薄膜分步电泳法不仅快速简便，检测灵敏度高(检出限0.1 g/L)，还可以进行定量分析，尤其可以同时检测多个样品，简便快速、成本消耗低，可以作为HP生产厂以及国家药检部门HP原料药质量控制的常规检测方法。

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