高磺化β环糊精毛细管电泳分离分析手性芳香仲醇

　　　　作者：刘鹏 何炜 秦向阳 王巧峰 李晓晔 张生勇

【摘要】 以高磺化β环糊精为毛细管电泳手性选择剂，建立了有效分离7种手性芳香仲醇对映体的方法。在20 mmol/L H3PO4三乙醇胺为背景电解质(pH 2.5)，6%(m/V) 高磺化β环糊精为手性选择剂(SβCD)，柱温20 ℃，操作电压-15 kV，检测波长214 nm等优化条件下，所有芳香仲醇对映体均实现基线分离。以本方法测定了7种芳香酮不对称氢转移反应产物7种手性芳香仲醇的百分对映体过量值(% ee)，其测定结果与高效液相色谱、气相色谱测定结果完全一致。本方法可以用于手性芳香仲醇光学纯度的测定。

【关键词】 毛细管电泳，手性选择剂，环糊精， 手性分离，手性芳香仲醇，百分对映体过量值

　1 引 言

　　手性芳香仲醇是重要的手性化合物，很多天然有机化合物和具有生理活性的物质都含有手性芳香仲醇的结构，采用高效液相色谱(HPLC)法对其进行分离测定已有文献报道[1，2]，而通过毛细管电泳测定的工作较少[3，4]。带负电的磺酰化β环糊精(SβCD)手性选择剂已被广泛用于一系列中性和带电化合物的毛细管电泳手性分离[5～7]，但却未见用于手性芳香仲醇光学纯度测定的研究报道。

　　不对称氢转移反应是获得手性芳香仲醇的重要途径之一[8]。为了提高该类反应产物的光学纯度，已设计合成了大量的新型手性催化剂[9，10]。如何评价这些催化剂的性能(特别是立体选择性)已成为迫切需要解决的问题。为了建立方便、快速和灵敏的百分对映体过量值(% ee)的测定方法，本实验以SβCD为手性选择剂，H3PO4三乙醇胺为背景电解质，建立了毛细管电泳拆分芳香仲醇对映体和测定不对称氢转移反应产物的百分对映体过量值(% ee)的方法。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　P/A CETM MDQ型毛细管电泳仪系统(美国Beckman公司); 配有二极管阵列检测器，BeckmanSystem Gold软件和可控温度卡盒; 熔融空心石英毛细管柱(75 μm i.d.×375 μm o.d.， 总长 60 cm，有效长度50 cm， 河北永年锐沣色谱器件有限公司); 343型自动旋光仪(美国PerkinElmer公司); 320S pH计(Metter Toledo公司); Delta 320S pH计(中国上海Metter Toledo公司)。

　　高磺化β环糊精(SβCD)(美国SigmaAldrich公司); 2甲基1苯基1丙酮、间三氟甲基苯乙酮(美国Acros公司); 1苯基1丁酮(美国Alfa Aesar公司); H3PO4(HPLC级，天津市科密欧化学试剂开发中心); NaOH(优级纯，中国医药集团上海化学试剂公司进口分装); 三乙醇胺(天津市红岩化学试剂厂)。其它试剂均为分析纯。实验用水为去离子水(MilliQ系统纯化)。

　　运行缓冲液的配制：准确移取0.068 mL H3PO4，用去离子水稀释至50.0 mL，浓度为20.0 mmol/L，在pH计监控下，用三乙醇胺调至pH 2.5，精密移取6.0 mL，在其中溶解36 mg SβCD，即得6 g/L [6%(m/V)] SβCD的运行缓冲液(缓冲液均为实验前现配，防止SβCD水解)。

　　样品溶液的配制：称取外消旋或对映体纯的芳香仲醇10 mg，用40%甲醇定溶至10 mL。实验前，用甲醇稀释至50 mg/L(外消旋体)或1 g/L(左旋体芳香仲醇)，进行分离实验。

　　运行缓冲液和样品溶液需经0.22 μm微孔滤膜过滤，超声脱气5 min后使用。所有储备液均应保存于4 ℃ 冰箱中。

　　2.2 实验方法

　　所有测试用外消旋芳香仲醇样品均以相应的芳香酮为原料，在无水甲醇中用NaBH4还原制备。所测定的7种左旋体芳香仲醇样品是本实验室通过相应芳香酮的不对称氢转移反应获得[10]。7种芳香仲醇的化学结构见图1。 图1 7种芳香仲醇的化学结构

　　在50 mL圆底烧瓶中加入5 mmol 芳香酮，25 mL无水甲醇，摇匀，待芳香酮溶解后加入0.227 g NaBH4，室温搅拌40 min，薄层层析法(TLC)监控(展开剂为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)= 9∶1混合液，反应结束后，减压蒸除甲醇，快速柱层析分离，得外消旋芳香仲醇无色液体。IR(KBr， cm-1): 3300(s)， 3050(w)， 2900(m)， 1600(s)， 1500(m)， 1200(m)和1000(s)。

　　3 结果与讨论

　　本实验中毛细管电泳手性分离度按式(1)计算：RS=2t2-t1w1+w2(1)式中，t1和t2是两个对映体的迁移时间，w1和w2是对映体各自以时间(min)为单位的基线峰宽。

　　本实验中手性芳香仲醇百分对映体过量值(% ee)按式(2)计算：ee(%)=A1-A2A1+A2×100(2)式中，A1和A2表示对映体的相关峰面积，A/t表示对映体各自峰面积除以相应的迁移时间(假定A1是不对称反应主要产物的相关峰面积)。

　　3.1 背景电解质类型对分离的影响

　　以SβCD为手性选择剂，在反极性电压模式下，分别考察了3种缓冲体系(H3PO4三乙醇胺、H3PO4三乙胺和TrisH3PO4)。实验表明，在20 mmol/L H3PO4三乙醇胺缓冲体系中， 7种手性芳香仲醇均能得到基线分离。因此，选择H3PO4三乙醇胺为毛细管电泳分析的缓冲溶液。

　　3.2 SβCD浓度对分离度和迁移时间的影响

　　考察了SβCD浓度分别为2%， 3%， 4%， 5%， 6%， 7%， 8%(m/V) 时各芳香仲醇分离度(Rs)。结果表明(图2a)，随着SβCD浓度增大，几乎所有分析物的Rs都先增加后下降。当SβCD浓度为6%(m/V)时，(±)Ⅰ， (±)Ⅱ， (±)Ⅳ， (±)Ⅴ和(±)Ⅶ 获得最好的分离，而(±)Ⅲ和(±)Ⅵ 达到最大Rs的SβCD浓度分别为3%和7% (m/V)。因SβCD浓度增加，其与芳香仲醇对映体形成包合物的稳定性增加，左、右旋体的包合常数差异变大，因而Rs增大。当SβCD浓度达到8%(m/V)时，电流已经&>200 μA，焦耳热迅速增加，基线噪音明显增大，色谱峰变形。另外，随着SβCD浓度增大，所有分析物的迁移时间(t)明显缩短(图2b)，有利于快速分析。综合考虑，分离(±)Ⅰ， (±)Ⅱ， (±)Ⅳ～Ⅶ用6%(m/V)SβCD较为合适，而分离(±)Ⅲ其浓度为3%(m/V)。

　　分离条件(separation conditions): 毛细管(capillary)， 60 cm [50 cm 有效长度(effective length) × 75 μm i.d.]; 背景电解质(background electrolyte， BGE)：20 mmol/L H3PO4三乙醇胺缓冲液(phosphate buffertriethanolamine)， pH 2.5; 温度(temperature) 20 ℃; 应用电压(applied voltage) -15 kV; 检测波长(UV detection at) 214 nm. Ⅰ～Ⅶ同图1(Ⅰ-Ⅶ are same as in Fig.1).3.3 缓冲溶液酸度对分离度和迁移时间的影响

　　高pH下，毛细管柱表面SiOH解离，负电荷密度增加，电渗流(EOF)增加;随着pH降低，SiOH解离受到抑制，EOF降低。当pH&<2.5时，质子化作用使EOF趋于0，pH改变对EOF的影响降至很小，这时pH只影响样品的解离平衡[12]。另外，pH也影响SβCD的电荷，进而对SβCD与客体分子间的疏水、氢键以及包络作用等产生影响。本实验中负电性的SβCD与中性的芳香仲醇形成带负电的络合物，在反极性电压模式下迁向正极，而电渗流则移向负极，这使中性芳香仲醇对映体得以分离。

　　本实验在20 mmol/L H3PO4中，用三乙醇胺调pH值分别为2.0， 2.5， 3.0， 3.5及4.0。以6%(m/V) SβCD考察了缓冲液pH对分析物Rs和迁移时间t的影响。结果表明(图3)： 当pH=2.5时，除(±)Ⅱ和(±)Ⅲ外，其它分析物的Rs均达到最大;当pH=3.0时，(±)Ⅲ的Rs达到峰值;当pH=3.5时， (±)Ⅱ的Rs最大。在pH=2.5时，(±)Ⅱ和(±)Ⅲ已经实现了基线分离。当pH继续升高时，因电流减小，EOF不断增大，使所有分析物的Rs又趋于下降。另外，EOF增大，样品移向正极的时间也明显延长。综合考虑，本实验选定的最合适pH值为2.5。

　　分离条件(separation conditions): 背景电解质(BGE)为 6%(m/V) SβCD; 其它条件同图2(other separation conditions are the same as in Fig.2)。Ⅰ～Ⅶ同图1(Ⅰ-Ⅶ are same as in Fig.1).3.4 缓冲液浓度对分离度和迁移时间的影响

　　分别取15， 20， 25， 30， 40及50 mmol/L H3PO4，适量用三乙醇胺调至pH=2.5，在-15 kV， 20 ℃电泳条件下测定。结果表明(图 4)，随着H3PO4浓度增大，所有分析物的Rs都增大; 当H3PO4浓度为20～25 mmol/L时，Rs达到最大值;再增大其浓度，Rs又缓慢下降，但迁移时间持续延长。因为在EOF趋于零时，随着缓冲液浓度增加，使分离样品表面的屏蔽作用增加，使表观电荷减小，荷质比下降，有效淌度减小，迁移时间增加，Rs得到改善[13]。然而，缓冲液浓度继续增大时，峰电流的增加将导致焦耳热的增加并最终引起峰变形，同时，由于迁移时间延长，区带展宽，并影响了Rs的增加。综合考虑，H3PO4浓度选择20 mmol/L。

　　分离条件(separation conditions): 背景电解质(BGE)： 6%(m/V) SβCD; 其它条件同图2(other separation conditions are the same as in Fig.2 )。Ⅰ～Ⅶ同图1(Ⅰ～Ⅶ are the same as in Fig.1).3.5 毛细管柱温和工作电压对分离度和迁移时间的影响

　　毛细管柱温变化不仅影响分离重现性，也影响分离效率。在通常条件下，电渗淌度(μeo)和电泳淌度(μep)与溶液粘度、双电层zeta电位和介电常数的关系可用式(3)和式(4)表示[14]: μeo=εoεrξη(3)

　　μep=2εoεrξ3η(4)式中，η为缓冲液粘度，ξ为zeta电位，εr为介电常数，εo为真空介电常数。由式(3)和式(4)可知， μeo和μep与溶液粘度成反比。当温度升高时，缓冲液粘度降低， μeo和μep随之增大， EOF减小，而电泳速度增大，迁移时间缩短;另一方面， SβCD和对映体之间的包合作用是一个快速的平衡过程，平衡常数随温度的增加而减小。因此，温度逐渐升高时，样品的Rs下降。综合考虑，最佳温度为20 ℃。

　　电压对Rs和t的影响结果见图5。随着分离电压的增加，对映体的Rs增大，迁移时间缩短，有利于芳香醇的手性分离。但当电压超过-15 kV时，电流超过-170 μA，焦耳热快速增加，使柱效反而降低，样品峰高也随之降低。因此，本实验选择的分离电压为-15 kV。

　　分离条件(separation conditions): 除电压外，其它条件同图2(except applied voltage， other separation conditions are the same as in Fig.2)。Ⅰ～Ⅶ同图1(Ⅰ～Ⅶ are the same as in Fig.1).3.6 优化条件下的电泳分离

　　通过对各种分离条件的考察，实现 7 种外消旋芳香仲醇有效分离的最佳条件是：在反极性电压模式下，区带毛细管电泳(CZE) 运行缓冲液为20 mmol/L H3PO4三乙醇胺，pH 2.50， SβCD浓度为6%(m/V)，柱温20 ℃，分离电压-15 kV。此条件下，7种手性芳香仲醇实现了基线分离，其电泳图见图6。

　　3.7 样品测定

　　用本方法测定了7种不对称氢转移反应产物的百分对映体过量值(% ee)，并与HPLC或GC方法测定结果进行比较(表1)。所有样品测定5次，相关峰面积(A/t)和迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为3.8%和1.4%。结果表明，用CZE方法测定的7种不对称氢转移反应产物样品的ee值与传统的HPLC或GC法测定结果有很高的一致性，测定ee典型的电泳图见图7。证明本方法准确可靠，能用于手性芳香仲醇的分离分析和对映体过量值的测定。分离条件(separation conditions): 背景电解质(BGE)： 20 mmol/L H3PO4三乙醇胺缓冲液(phosphate buffertriethanolamine)， 6%(m/V) SβCD; pH 2.5; 其它条件同图2(other separation conditions are the same as in Fig.2)。表1 7种芳香仲醇百分对映体过量值的CZE和HPLC或GC测定结果[α]25D绝对构型a

　　ConfigurationaⅠ94.595.0-47.5SⅡ93.794.0-32.4SⅢ95.496.0-43.0SⅣ96.397.0-48.1SⅤ94.295.0-20.7SⅥ96.797.0-51.6SⅦ76.477.0-20.9S a. 手性芳香仲醇的绝对构型是根据其旋光方向与同一已知化合物进行比较而确定(configuration were assigned by comparison with the sign of specific rotation of known compounds)。图7 7种芳香仲醇的百分对映体过量值测定的毛细管电泳色谱图

参考文献

　　1 Wainer W， Stiffin R M， Shibata T. J. Chromatogr.， 1987， 411: 139～151

　　2 Fukui Y， Ichida A， Shibata T， Mori K. J. Chromatogr.， 1990， 515: 85～90

　　3 Zhu W， Vigh G. Anal. Chem.， 2000， 72(2): 310～317

　　4 Zhang Y P， Lee K P， Kim S H， Choi S H， Gopalan A I， Yuan Z B. Electrophoresis， 2004， 25(16): 2711～2719

　　5 Stalcup A M， Gahm K H. Anal. Chem.， 1996， 68(8): 1360～1368

　　6 Zhao Yan(赵 燕)，Sun XiaoLi(孙晓莉)，Yang XingBin(杨兴斌)，Nan PengJuan(南鹏娟)，Jin Ying(金 瑛)，Zhang ShengYong(张生勇). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2006， 34(3) : 293～297

　　7 He Min(何 敏)， Zhao ShuLin(赵书林)， Chen Jie(陈 洁). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2006， 34(5): 655～658

　　8 Palmer M J， Wills M. Tetrahedron: Asymmetry， 1999， 10: 2045～2061

　　9 Hayes A M， Morris D J， Clarkson G J， Wills M. J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127: 7318～7319

　　10 Li Y Y， Zhang H， Chen J S， Liao X L， Dong Z R， Gao J X. J. Mor. Catal. A: Chem.， 2004， 218(2): 153～156

　　11 He W， Zhang B L， Jiang R， Liu P， Sun X L， Zhang S Y. Tetrahedron Lett.， 2006， 47: 5367～5370

　　12 Fu RuoNong(傅若农). Chromatography Analyesis Outline(色谱分析概论)(Edition 2nd， 第二版). Beijing(北京): Chemical Industry Press(化学工业出版社)， 2005: 225～227

　　13 Mechref Y， Ostrander G K， Rassi Z E. J. Chromatogr. A， 1997， 792: 75～82

　　14 Knox J H. J. Chromatogr. A， 1994， 680: 3～13