光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合结构域的相互作用

【摘要】 利用荧光滴定法研究了9种金属离子与序列特异性的DNA结合结构域(p53DBD)的结合反应，其结合能力依次为Fe3+&>Zn2+&>Cu2+&>Ca2+&>Mg2+&>Ba2+&>Mn2+&>Ni2+&>Co2+。圆二色谱研究结果表明，Ba2+， Ca2+， Co2+， Mn2+及Ni2+并未引起蛋白二级结构变化;　Zn2+， Mg2+及Fe3+诱导蛋白结构细微调整;而Cu2+结合导致蛋白螺旋结构大量丢失。ANS结合研究结果表明， Mg2+与Zn2+相似，诱导p53DBD蛋白表面疏水性增强，而Fe3+引起p53DBD蛋白表面疏水性降低。因此，Mg2+和Fe3+可能是影响或调节p53活性的潜在因子之一。

【关键词】 金属离子， 蛋白结构， 亲和性， 疏水性， 荧光光谱

　　1 引 言

　　自然界中大约1/4的蛋白需要金属离子的协助才能发挥正常功能[1，2]。肿瘤抑制蛋白p53是Zn2+结合蛋白，它调控很多重要的生物学过程[3]。p53响应于多种DNA损伤事件，被激活后作为一个转录因子进一步激活下游基因，从而可以导致细胞周期停留在G1/S期修复或者诱导凋亡[4]。所有这些已知的生物学功能都依赖于其DNA结合特性[5]。野生型p53通过一个序列特异性的DNA结合结构域(p53DBD)来结合DNA[6]。p53基因在50%肿瘤中发生突变[7]，而这些突变主要发生在p53DBD，突变的p53不能激活下游基因转录[8]。因此，p53DBD结合和转录激活活性是p53最关键的生物学功能。晶体结构研究结果表明，p53核心结构域结构为β三明治结构形成脚手架，支撑2个大环和1个环片层螺旋模序。2个大环形成空腔结合Zn2+，而环片层螺旋模序形成p53DNA结合表面。p53DBD上的3个半胱氨酸(Cys176， Cys238和Cys242)和1个组氨酸(His179)结合1个Zn2+[9]。Zn2+的结合被认为是p53核心结构域正确折叠所必需的，这种结合如果被破坏将会使p53DBD减弱甚至失去DNA结合和转录下游基因的功能[10]。核磁共振研究表明：在没有Zn2+的情况下，p53蛋白的DNA结合表面发生了结构变化;荧光各向异性研究表明：Zn2+的去除使p53DBD失去了位点特异性的DNA结合活性，但保留着非特异性的DNA结合活性[11]。另外，Cu2+结合p53蛋白，却导致p53构象和DNA结合活性的破坏[12]。然而，金属离子与p53DBD的结合平衡的研究尚未见报道。

　　细胞内存在多种金属离子，为了研究这些金属离子是否结合并影响p53DBD，本实验克隆并纯化了p53DBD蛋白，并在体外应用光谱法研究这些金属离子与p53DBD蛋白的结合反应，以及金属离子对蛋白结构及表面疏水性的影响。

2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　F4500荧光分光光度计(日本日立公司); Jasco J715分光偏振计(日本分光株式会社)。8苯胺1萘磺酸(ANS，Sigma公司);二硫苏糖醇(DTT，Merck公司);NaCl(天津市试剂六厂);蔗糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、TrisBase及咪唑均购于北京鼎国试剂公司;ZnCl2， MgCl2， CaCl2， FeCl3， MnCl2， CoCl2， CuCl2， BaCl2及NiCl2均购于天津大学科威公司。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

　　高渗缓冲液A(20 mmol/L TrisHCl，2.5 mmol/L EDTA，200 g/L 蔗糖，pH 8.0);低渗缓冲液B(20 mmol/L TrisHCl，2.5 mmol/L EDTA，pH 8.0);缓冲液C(20 mmol/L TrisHCl，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl2，pH 8.0);缓冲液D(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl，5 mmol/L 咪唑，pH 8.0);缓冲液E(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl，80 mmol/L 咪唑，pH 8.0);缓冲液F(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl， 300 mmol/L 咪唑，pH 8.0);缓冲液G(50 mmol/L TrisHCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，pH 7.5)。

　 2.2 p53DBD的基因克隆、蛋白表达与纯化

　　利用密度梯度离心法从人全血中分离单个核细胞，然后使用TRIzol法从单个核细胞中提取总RNA。以5′TCCCAAGCAATGGATGAT3′和5′TTTATGGCGGGAGGTAGA3′为引物，通过RTPCR方法从总RNA中克隆出肿瘤抑制蛋白p53cDNA片段。然后以5′ATCGTCTCCCATGGCTGTCCCTTCCCAGAAAA CCT3′和5′ATATCTCGAGTCACAGTGCTCGCTTAGTGCTC3′为引物PCR编出氨基酸96～308的p53DBD基因片段。这个基因片段被克隆进表达载体pET32a(novagen)。重组质粒通过碱裂解法制备，测序证明插入序列的正确性。核心的DNA结合结构域在Escherichia coli BL21 (DE3) trx B-中过量表达。细菌在LB培养基中37 ℃培养直到吸光度值A600达到0.6～1.0。用0.25 mmol/L异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达，25 ℃条件下继续孵育6 h。后续的步骤都在4 ℃下进行。离心收集菌体，然后重悬于高渗缓冲液A中30 min。离心重新收集后，细菌溶解在低渗缓冲液B中裂解45 min。不溶物以13000 r/min离心30 min去除。蛋白上清液用缓冲液C透析12 h，然后流经缓冲液D平衡的亲和色谱柱(qiagen)。色谱层析后用缓冲液E清洗杂蛋白，用缓冲液F洗脱重组蛋白。洗脱的蛋白组分利用SDSPAGE检测。重组的p53DBD蛋白进一步利用Sephadex G75凝胶过滤柱(pharmacia)于缓冲液C中纯化。从凝胶过滤柱中收集的蛋白用肠激酶在25 ℃下酶切7 h。酶切蛋白再次利用Sephadex G75凝胶过滤柱于缓冲液G(50 mmol/L TrisHCl， pH 7.5， 100 mmol/L NaCl， 1 mmol/L DTT)中进一步纯化。纯化的p53DBD蛋白用2.5 mmol/L EDTA处理以去除Zn2+，然后流经Sephadex G75凝胶柱更换缓冲液为缓冲液G。最后SDSPAGE电泳检测纯度，运用Bradford法以牛血清白蛋白为标准测定蛋白浓度。

　　2.3 荧光滴定

　　在室温条件下，以295 nm为激发波长，记录310～450 nm的发射谱。激发和发射的光谱带宽设置为5 nm，每个数据点测量3次。蛋白浓度为1.8 μmol/L，滴定反应于缓冲液G中进行。每个数据点都扣除背景，作荧光校正。

　　2.4 圆二色谱研究

　　圆二色谱测量在Jasco J715分光偏振计上进行，以1 mm石英比色皿为样品池，扫描波长范围为200～250 nm。每一个数据点取6次扫描的平均值。100 μmol/L金属离子与4.0 μmol/L蛋白结合反应于缓冲液G中进行。每个数据点都通过减去背景谱校正。

　　2.5 ANS结合研究

　　通过测量ANS的荧光增强来测量ANS(8苯胺1萘磺酸)与p53DBD的结合。100 μmol/L金属离子与1.8 μmol/L蛋白于缓冲液G中温浴30 min后，加入50 μmol/L ANS，然后测量ANS荧光光谱。激发波长设置为380 nm，发射谱扫描400～600 nm。所有的测量都通过减去缓冲液背景进行荧光校正。

　　 3 结果与讨论

　　3.1 p53DBD表达、纯化以及内源的荧光性质

　　为了研究不同金属离子与p53DBD的结合反应，本实验克隆、表达并纯化了编码96～308氨基酸的p53DBD蛋白。SDSPAGE分析表明，24 kDa的p53DBD蛋白在纯化的部分中占主要部分(图1A)。蛋白的浓度为170 mg/L。图1B表示在室温条件下纯化的p53DBD蛋白于标准缓冲液G中的荧光发射谱。激发波长为295 nm，在此波长下只有色氨酸被激发。根据文献[13]报道，当发射谱最大波长在330～332 nm之间，表示色氨酸残基埋藏在蛋白的非极性区域内;当发射谱最大波长在340～342 nm之间，说明色氨酸残基固定在蛋白的表面并且与水接触受限;当发射谱最大波长在350～353 nm之间，表示色氨酸残基完全暴露于水中。分析p53DBD的荧光发射光谱表明重组蛋白在295 nm被激发时，最大发射波长为340 nm。这与p53DBD晶体结构色氨酸位于蛋白表面的结果相一致[9]。当p53DBD蛋白用4.2 mol/L盐酸胍处理1 h后，最大发射波长红移到352 nm，同时荧光强度降低，说明色氨酸残基转移到一个更强极性的环境之中。

　　3.2 金属离子与肿瘤抑制蛋白p53DBD的结合

　　金属离子与p53DBD结合的定量测量可以通过测量p53DBD荧光光谱的变化来完成。文献[14] 已报道金属离子的结合能够导致荧光发射强度的降低。本实验观测到p53DBD的荧光强度随着9种金属离子滴定的进行而逐渐减弱(图2A)。金属离子与蛋白的结合通常可以分为动态猝灭和静态猝灭这两种。动态猝灭涉及到在激发态短暂存在的瞬间荧光团与猝灭剂的接触。动态猝灭和静态猝灭都可以用SternVolmer方程来描述。F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](1)F和F0分别表示在有和无猝灭剂存在的情况下，p53DBD蛋白的荧光强度。Kq是生物分子的猝灭速率常数;KSV是SternVolmer猝灭常数;τ0是生物分子在没有猝灭剂的情况下的平均寿命;[Q]是猝灭剂的浓度。可以通过式(1)直线的斜率得到KSV(图2B)。根据文献[15]报道，生物分子的τ0值约为10-8 s，因此可以计算出猝灭速率常数Kq，其值列于表1中。生物分子与不同的猝灭剂所产生的最大碰撞猝灭常数为2.0×1010 L/(mol·s)[16]。从表1可见，9种金属离子导致p53DBD荧光猝灭的速率常数远大于碰撞猝灭常数。这些数据说明荧光猝灭是静态猝灭。

　　Fig.2 A. Fluorescence emission spectra of 1.8 μmol/L p53DBD treated with increasing amounts of Ba2+; B. SternVolmer plots of fluorescence quenching of p53DBD with Ba2+; C. Logarithmic plots of fluorescence quenching of p53DBD treated with Ba2+静态猝灭涉及荧光团猝灭剂复合物的形成。在一个静态猝灭过程中，假设p53DBD蛋白上有n个配体结合位点，猝灭反应可以表示为方程(2)。

　　[p53DBD]和[Q]分别表示自由蛋白和配体的浓度，[Qn·p53DBD]表示蛋白复合物的浓度。总蛋白浓度等于自由蛋白与蛋白复合物浓度之和，因此，方程(3)可以变为方程(4)。

　　Ka=[p53DBD]tot-[p53DBD][Q]n·[p53DBD](4)

　　体系中，荧光强度与蛋白浓度成正比，所以

　　lgF0-FF=lgKa+nlg[Q](6)

　　在此方程中，n表示结合位点数。Ka和n可以通过线性关系lg(F0-F)/F对lg[Q]的截距和斜率得到[17](图2C)。

　　从表1中可以看出，金属离子结合p53DBD蛋白亲和性依次为Fe3+&>Zn2+&>Cu2+&>Ca2+&>Mg2+&>Ba2+&>Mn2+&>Ni2+&>Co2+。表1 金属离子与p53DBD的结合常数(Ka)、解离常数(Kd)、结合位点数(n)以及猝灭速率常数(Kq)

　 3.3 p53DBD二级结构的变化

　　内源荧光变化表示了色氨酸残基局部微环境的变化在一定程度上反映了p53DBD三级结构的变化。采用远紫外圆二色谱测量金属离子对p53DBD蛋白二级结构的影响(图3)。p53DBD远紫外圆二色谱曲线在208和220 nm处表现出2个负的特征峰，这是蛋白质α螺旋典型的特征峰。Ba2+， Ca2+， Co2+， Mn2+及Ni2+并不引起p53DBD蛋白二级结构变化。 图3 蛋白与金属离子作用的远紫外圆二色谱

　　1. p53DBD; 2. (1)+Mg2+; 3. (1)+Zn2+; 4. (1)+Fe3+; 5. (1)+Cu2+.而Zn2+， Mg2+， Fe3+和Cu2+结合p53DBD蛋白，引起圆二色谱两个负的特征峰值的降低，说明这些离子的结合导致了蛋白螺旋结构降低(图3)。Zn2+， Mg2+和Fe3+作用相对较弱，引起蛋白螺旋结构的细微改变。Zn2+结合p53DBD使得蛋白上的两个大环连接在一起，从而进行DNA特异性结合[11]。而Cu2+作用引起了蛋白螺旋结构大量丢失，这与文献[12]报道的Cu2+结合p53导致p53构象和DNA结合活性的破坏相一致。

　　3.4 p53DBD疏水性研究

　　考察了结构荧光探针与p53DBD的结合。ANS在水相缓冲液中荧光较弱，但是结合蛋白疏水区域后其荧光发射谱显著增强。因此，可以通过测量ANS的荧光变化研究p53DBD蛋白的疏水性变化[18]。图4A表示的是ANS与p53DBD结合后的荧光光谱图，其激发波长为380 nm，最大发射波长为478 nm。当p53DBD蛋白与不同金属离子结合以后，其ANS荧光有不同程度的增强。从图4B可见，Ba2+， Ca2+， Co2+， Mn2+及Ni2+并没有引起p53DBD疏水性显著变化，Zn2+， Mg2+和Cu2+结合诱导蛋白表面疏水性增强，而Fe3+引起了p53DBD蛋白表面疏水性降低。p53DBD的晶体结构表明[9]，p53核心结构域结构为一个β三明治结构形成脚手架，支撑2个大环和1个环片层螺旋模序。2个大环形成空腔结合Zn2+，因此Zn2+结合诱导蛋白表面疏水性增强。

　4 结 论

　　综合以上实验结果，Ba2+， Ca2+， Co2+， Mn2+及Ni2+虽然结合p53DBD蛋白，但是并未引起蛋白结构和疏水性的改变;Zn2+结合p53DBD蛋白诱导蛋白结构细微调整，并引起表面疏水性增强，使得蛋白上的2个大环连接在一起，从而具备DNA特异性结合活性;Cu2+结合导致蛋白螺旋结构大量丢失，破坏p53构象和DNA结合活性;Mg2+和Fe3+都能诱导蛋白结构细微调整，Mg2+诱导蛋白表面疏水性增强，其作用方式可能与Zn2+类似，而Fe3+导致p53DBD蛋白表面疏水性降低。因此，Mg2+和Fe3+可能是影响或调节p53活性的潜在因子之一。

参考文献

　　1 Tottey S， Waldron K J， Firbank S J， Reale B， Bessant C， Sato K， Cheek T R， Gray J， Banfield M J， Dennison C， Robinson N J. Nature， 2008， 455: 1138～1142

　　2 Glusker J P， Katz A K， Bock C W. The Rigaku Journal. 1999， 16: 8～16

　　3 Ko L J， Prives C. Genes Dev.， 1996， 10: 1054～1072

　　4 Levine A J. Cell， 1997， 88: 323～331

　　5 Prives C. Cell， 1994， 78: 543～546

　　6 Bargonetti J， Manfredi J J， Chen X， Marshak D R， Prives C. Genes Dev， 1993， 7: 2565～2574

　　7 Hainaut P， Soussi T， Shomer B， Hollstein M， Greenblatt M， Hovig E， Harris C C， Montesano R. Nucl. Acids Res.， 1997， 25: 151～1578 Pietenpol J A， Tokino T， Thiagalingam S， elDeiry W S， Kinzler K W， Vogelstein B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1994， 91: 1998～2002

　　9 Cho Y， Gorina S， Jeffrey P D， Pavletich N P. Science， 1994， 265: 346～355

　　10 Meplan C， Richard M J， Hainaut P. Oncogene， 2000， 19: 5227～5236

　　11 James S B， Stewart N L. Biochemistry， 2003， 42: 2396～2403

　　12 Verhaegh G W， Richard M J， Hainaut P. Mol. Cell. Biol.， 1997， 17: 5699～5706

　　13 Burstein E A， Vedenkina N S， Ivkova M N. Photochem. Photobiol.， 1973， 18: 263～275

　　14 Bougie I， Charpentier S， Bisaillon M. J. Biol. Chem.， 2003， 278: 3868～3875

　　15 Lakowicz J R. Principles of Fluorescence Spectroscopy， Second Edition， Plenum Press， New York， 1999: 237～265

　　16 Lakowicz J R， Weber G. Biochemistry， 1973， 12: 4161～4170

　　17 Feng X Z， Lin Z， Yang L J， Wang C， Bai C L. Talanta， 1998， 47: 1223～1229

　　18 Slavik J. Biochim Biophys Acta， 1982， 694: 1～25