高效液相色谱法同时测定少毛北前胡中6种香豆素

　　　　作者：陈二林 刘小花 李文　封士兰　胡芳弟　宋平顺

【摘要】 建立了同时测定少毛北前胡中6种香豆素(香柑内酯、蝉翼素、丝立尼亭、顺3′，4′二千里光酰基3′，4′二氢邪蒿内酯、白花前胡丁素和白花前胡素E)含量的HPLC分析方法。色谱柱为Lot ValidationC18(150 mm×4.6 mm， 5 μm)柱;流动相为甲醇水;流速为0.8 mL/min;检测波长为323 nm;柱温30 ℃。6种香豆素在一定范围内线性良好，相关系数为0.9992～0.9999;精密度RSD均低于3.95%;平均回收率为93.0%～98.6%。本方法简便、快速、准确;并对其中一种香豆素化合物进行分离纯化，通过核磁、质谱等光谱分析方法确认了此化合物的结构。

【关键词】 少毛北前胡，香豆素，高效液相色谱法，结构

　　1 引 言

　　前胡(Radix Peucedani)是一种应用广泛的传统中药，正品前胡为伞形科前胡属Pecucedanum白花前胡(P.praerutorum)的干燥根，现代药理研究证明前胡对支气管炎、高血压、冠心病等有一定的疗效[1]。少毛北前胡(Peucedunum harrysmithii var subglabrum)，商品习称硬杆前胡，主产于甘肃省的陇南、天水、陇东等地区[2]。

　　香豆素类成分是前胡的主要有效成分，已测定了正品前胡中总香豆素及部分香豆素的含量[3～5]，而对于少毛北前胡中香豆素的含量测定未见报道。本研究建立了HPLC测定少毛北前胡中6种香豆素(香柑内酯、蝉翼素、丝立尼亭、顺3′，4′二千里光酰基3′，4′二氢邪蒿内酯、白花前胡丁素和白花前胡素E)含量的方法。本方法快速、准确，可用于少毛北前胡的质量控制。运用柱色谱及制备HPLC，分离纯化了其中的一种香豆素化合物，利用核磁、质谱及文献对照确认了此化合物的结构，首次从少毛北前胡中分离得到此化合物。此外，分析比较了少毛北前胡与正品前胡中的香豆素成分，为少毛北前胡作为正品前胡代用品可行性研究提供了科学依据。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　Ultimate 3000高效液相色谱仪(戴安公司)，包括四元泵、Photodiode Array检测器、手动进样器;GILSON制备高效液相色谱仪(依利特公司)，包括C18制备柱(250 mm×20 mm， 10 μm)， SHIMADZU VPODS分析柱，UV/VIS152检测器;HP5988气质联用仪(美国热电公司);Mercury Plus 400M核磁共振波谱仪(Varian公司);WRS1B数字熔点仪(上海精密科学仪器有限公司);KQ3200DB型数控超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司)。

　　对照品：香柑内酯(1)、蝉翼素(2)、丝立尼亭(3)、顺3′，4′二千里光酰基3′，4′二氢邪蒿内酯(4)、白花前胡丁素(5)和白花前胡素E(6)均由实验室自制，化合物结构通过质谱、HNMR和CNMR数据及与文献[6～9]对照确认了它们的结构(见图1)。以HPLC面积归一化法分析，纯度均&>98%;少毛北前胡于2006年9月采自甘肃省不同县，经甘肃省药品检验所生药室宋平顺主任药师鉴定。甲醇为色谱纯(山东禹王试剂公司)，水为二次蒸馏水，其它试剂为分析纯，购于天津科密欧试剂公司，色谱硅胶为青岛海洋化工厂生产。

　　1. 香柑内酯(bergapten); 2. 蝉翼素(pteryxin); 3. 丝立尼亭(selinidin); 4. 顺3′，4′二千里光酰基3′，4′二氢邪蒿内酯(cis3′，4′disenecioyl3′，4′dihydroseselin); 5. 白花前胡丁素 (peculedanumⅡ， PdⅡ); 6. 白花前胡素E (pecucedanumⅢ， PdⅢ)。

　　2.2 色谱条件

　　Lot ValidationC18色谱柱(150 mm×4.6 mm， 5 μm)，流动相为甲醇水，洗脱程序如下： 0～9 min，V(甲醇)∶V(水)=77.5∶22.5; 9～18 min，100%甲醇;18～25 min，V(甲醇)∶V(水)=77.5∶22.5。流速为0.8 mL/min; 柱温为30 ℃; 进样量为20 μL; 检测波长为323 nm。

　　2.3 对照品溶液的制备

　　准确称取各对照品适量，用甲醇溶解并定容，得到0.0204 g/L香柑内酯、1.964 g/L蝉翼素、0.0264 g/L丝立尼亭、0.1014 g/L顺3′，4′二千里光酰基3′，4′二氢邪蒿内酯、0.1642 g/L白花前胡丁素和0.1106 g/L白花前胡素E的对照品储备液，4 ℃贮存备用。

　　2.4 样品溶液的制备

　　分别取甘肃不同产地的少毛北前胡、白花前胡和紫花前胡药材，粉碎，过0.30 mm孔径筛，准确称取1.000 g，分别加氯仿50， 40和30 mL，超声提取，每次30 min，合并滤液，蒸干氯仿，残渣加甲醇溶解，定容至10 mL，经0.40 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液进样，测定。

　　3 结果与讨论

　　3.1 化合物4的分离纯化与结构鉴定

　　3.1.1 分离纯化 少毛北前胡药材经甲醇提取，氯仿萃取后所得浸膏，先经硅胶柱色谱进行粗分离，洗脱剂为石油醚乙酸乙酯，所得部分通过HPLC分析，摸索出所需物与杂质较好的分离条件后，采用制备HPLC进行分离纯化，富集所需样品。色谱条件为V(甲醇)∶V(水)=80∶20，室温，流速10 mL/min，每次进样5 mL。收集所需流份，蒸干溶剂，待有机溶剂挥干后，得单体化合物，经HPLC面积归一化分析，纯度大于98%。

　　3.1.2 结构鉴定 化合物4： 白色针晶， 分子式为C24h36O7，mp 113～114 ℃，紫外灯下呈蓝紫色荧光。EIMS m/z：426 [M]+，326，311，229，83(100)，55，43;1HNMR (CDCl3 400 MHz) δ：6.20(1H， d， J=9.6 Hz， H3)， 7.58(1H， d， J=9.6 Hz， H4)， 7.35(1H， d， J=8.8 Hz， H5)， 6.80(1H， d， J=8.8 Hz， H6)， 5.36(1H， d， J=5.2Hz， H3′)， 6.62(1H， d， J=5.2Hz， H4′)， 1.46(3H， s， 2'CH3)， 1.42(3H， s， 2′CH3)， 5.67， 5.63(2H， br.s， H2″×2)， 2.19， 2.15(6H， s， 4″CH3×2)， 1.89， 1.88(6H， s， 5″CH3×2)。13CNMR(CDCl3 100 MHz) δ：159.80(C2)， 113.15(C3)， 143.10(C4)， 128.95(C5)， 114.29(C6)， 156.77(C7)， 107.63(C8)， 154.06(C9)， 112.49(C10)， 77.70(C2′)， 69.40(C3′)， 59.81(C4′)， 25.05， 22.60(2′CH3×2)， 165.16， 165.02(1″C×2)， 115.32， 115.25 (2″C×2)， 158.06， 157.35(3″C×2)， 27.35， 27.35(4″C×2)， 20.28， 20.28(5″C×2)。根据以上理化性质和波谱数据，确定化合物4为文献[8]报道的顺3′，4′二千里光酰基3′，4′二氢邪蒿内酯。首次从少毛北前胡中分离得到此化合物。

　　3.2 样品溶液制备条件的优化

　　取少毛北前胡药材适量，粉碎，过0.30 mm孔径筛，精确称取两份(1.0140和1.0126 g)。一份分别加入氯仿50， 40和30 mL，超声提取3次，每次30 min，合并滤液，蒸干氯仿，残渣用甲醇溶解并定容，0.40 μm微孔滤膜过滤，为样品溶液1。另一份分别加入氯仿50， 40和30 mL，回流提取3次，每次1 h，合并滤液，蒸干氯仿，残渣用甲醇溶解并定容，0.40 μm微孔滤膜过滤，为样品溶液2。取样品溶液1和2进行HPLC分析，结果差异不显著。因此，本实验采用方便快速， 而且提取物中其它杂质含量较少的超声提取法制备样品溶液。 图2 对照品(A)和少毛北前胡(B)的色谱图

　　3.3 色谱条件的优化

　　为了得到较好的HPLC条件，分别对流动相的组成、比例、流速和柱温进行了优化。甲醇在73%～79%范围内对于样品均有较好的分离效果，但在77.5%时，对于所测定的所有化合物分离效果最佳，因此确定V(甲醇)∶V(水)=77.5∶22.5。流速为1.0 mL/min时，对于化合物4和5的分离效果较差，流速为0.6 mL/min时分析时间太长，各化合物分离效果与0.8 mL/min时无明显差异，最终确定流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，各化合物均达到较好的分离效果。色谱图见图2。

　　3.4 方法学考察

　　3.4.1 标准曲线的制备 分别取2.3项的对照品储备液用甲醇稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，进样测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，各回归方程呈良好的线性关系(见表1)。表1 回归方程和检出限

　　cis3′，4′disenecioyl3′，4′dihydroseseliny=740.6x+1.51190.999910.1～182.50.6白花前胡丁素 PdⅡy=522.9x+1.36170.999416.4～295.60.7白花前胡素E PdⅢy=909.6x-2.44360.999211.1～132.70.6 y: 峰面积(peak area); x: 浓度(concentration) mg/L。3.4.2 精密度与回收率 取样品溶液测定日内和日间精密度。一天重复进样6次测定日内精密度; 连续检测3天，每天测定2次，确定日间精密度。结果见表2。

　　称取已知含量的少毛北前胡药材适量，定量加入6种对照品，按照2.4项操作制备样品溶液，进样测定，计算回收率。结果显示，各化合物的平均回收率为93.0%～98.6%，RSD&<3.7%。结果见表3。

　　3.5 样品测定

　　取白花前胡、紫花前胡和甘肃不同产地(华亭县、甘谷县、清水县、文县、康县、徽县)少毛北前胡样品，按照2.4项操作后，HPLC测定，结果见表4。

　　甘肃不同产地少毛北前胡所含的香豆素成分基本相同，但含量差别较大。香豆素化合物是前胡中主要的活性成分，因此，通过对前胡中香豆素含量的检测，可有效控制少毛北前胡药材的质量。比较甘肃不同产地的少毛北前胡、紫花前胡和白花前胡，少毛北前胡与紫花前胡化学成分差异较大，紫花前胡只检测到丝立尼亭，未检测到其它5种化合物，而少毛北前胡与白花前胡的化学成分较为相似，这为少毛北前胡作为正品前胡替代品的研究提供了科学依据。本方法快速、简便、准确、灵敏度高，可用于少毛北前胡的质量控制。表2 日内及日间精密度 表3 各香豆素化合物加标回收率测定结果

　　cis3′，4′disenecioyl3′，4′dihydroseselin0.06400.05000.111995.72.9白花前胡丁素 PdⅡ0.12700.10000.223596.51.7白花前胡素E PdⅢ0.05430.05000.103398.01.8 表4 甘肃不同产地少毛北前胡、白花和紫花前胡中香豆素的含量

参考文献

　　1 Shi BinRong (石贇蓉)， Kong LingYi(孔令义). World Science and Technology Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica(世界科学技术—中医药现代化)， 2005， 7(1): 38～46

　　2 Song PingShun(宋平顺)， Ding YongHui(丁永辉)， Zhang BoChong(张伯崇). Journal of Chinese Medicinal Materials(中药材)， 1994， 17(7)： 13～15

　　3 Peng Wei(彭 维)， Liu Bu Ming(刘布鸣)， Huang Ping(黄 平)， Zhang QingLan(张庆兰)， Zheng XueZhong(郑学忠)， Lai MaoXiang(赖茂祥). Journal of Chinese Medicinal Materials(中药材)， 1997， 20(1)： 25～28

　　4 Xu Qin(徐 勤)， Liu BuMing (刘布鸣)， Zhang ZhengXing(张正行). Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis(药物分析杂志)， 2001， 21(2)： 91～95

　　5 Xu Qin(徐 勤)， Deng LiDong(邓立东)， Liu BuMing(刘布鸣). West China Journal of Pharmaceutical Sciences(华西药学杂志)， 2001， 16(3)： 215～216

　　6 Zhang CaiYu(张才煜)， Zhang BenGang(张本刚)， Yang XiuWei(杨秀伟). Pharmaceutical Journal of Chinese People's Liberation Army(解放军药学学报)， 2007， 23(4): 241～245

　　7 Rao GaoXiong(饶高雄)， Niu FangDi(钮芳娣)， Sun HanDong(孙汉董). Acta Botanica Yunnanica(云南植物研究)， 1990， 12(4)： 434～438

　　8 Chang HaiTao(常海涛)， Li Xian(李 铣). Journal of Shenyang Pharmaceutical University(沈阳药科大学学报)， 1999， 16(2)： 103～106

　　9 Kong LingYi(孔令义)， Pei YueHu(裴月湖)， Li Xian(李 铣)， Wang SuXian(王素贤)， Hou BoLing(侯柏玲)， Zhu TingRu(朱廷儒). Acta Pharmaceutica Sinica(药学学报)， 1993， 28(10)： 772～776