1119～1124污泥和沉积物中微量大环内酯类、磺胺类抗生素、甲氧苄胺嘧啶和氯霉素的测定

　　　　 作者：唐才明　 黄秋鑫　余以义　彭先芝

【摘要】 利用超声波辅助萃取(USE)技术，联合固相萃取(SPE)净化浓缩以及液相色谱电喷雾串联质谱(LCESIMS/MS)技术，建立了城市污泥和河流底泥中微量痕量大环内酯类、磺胺类抗生素、甲氧苄胺嘧啶和氯霉素的多目标定量分析方法。样品经USE提取，SPE净化后，用LCESIMS/MS检测。选择C18为分析柱，甲醇、5 mmol/L醋酸铵和0.1%甲酸混合溶液为流动相，选择在ESI正电离源下多反应监测(MRM)模式检测。对比了USE和加速溶剂萃取(ASE)对抗生素的萃取效率，优化了萃取条件。结果表明: USE和ASE对所选抗生素的萃取效率相当; 而50%甲醇溶液在酸性条件下(pH 2)萃取效率最好。抗生素的方法检出限为2.2～66.9 ng/g(干重，下同); 回收率介于74.7%～111.8%之间; 相对标准偏差小于10.6%。应用此方法在广州某污水处理厂脱水污泥及某河涌底泥中检测到磺胺二甲基嘧啶、克拉霉素、脱水红霉素及罗红霉素等多种抗生素，含量为6.8～125.6 ng/g。

【关键词】 超声波萃取，液相色谱串联质谱，抗生素，污泥

　　1 引 言

　　大环内酯类(MLs)、磺胺类(SAs)、甲氧苄胺嘧啶和氯霉素均为常用的合成抗生素，广泛用于治疗和预防人类与动物疾病。人和动物使用这些抗生素后，其中40%～90%以原物或代谢物的形式随排泄物排出[1]，并可能进入环境，影响生态环境及人类健康。

　　目前，抗生素研究大多集中于水环境[4～6]，而复杂的固体环境介质(如城市污泥)中的抗生素研究较少。Gobel等[7]比较了加速溶剂萃取(ASE)和超声萃取技术(USE)对城市污泥中的部分SAs和MLs的萃取效率，但未就USE的萃取条件进行优化，因而，其萃取效率相对ASE稍低。ASE技术使用昂贵，在我国尚不普及，国内研究常采用高效液相色谱(HPLC) 检测抗生素[8～11]，然而环境样品中复杂的基质可能会干扰抗生素定性与定量的准确性。本研究采用超声波辅助提取，辅以固相萃取浓缩净化，通过液相色谱电喷雾串联质谱(LCESIMS/MS)技术，以内标法定量分析城市污泥及河流底泥等复杂环境介质中的抗生素。运用本方法检测了广州市污水处理厂脱水污泥和河涌底泥中抗生素污染物的浓度水平。

　　 2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　1200高效液相色谱(美国Agilent公司)，配自动进样器;6410 三重四级杆串联质谱仪(美国Agilent公司)，配有电喷雾电离源(ESI)及MassHunter Workstation数据处理系统;12孔固相萃取装置(美国Supelco公司);超声萃取仪(上海超声波仪器厂);高速冷冻离心机(美国Beckman公司);ASE300加速溶剂萃取仪(美国Dionex公司);冷冻干燥仪(德国Christ公司)。

　　磺胺嘧啶(SDZ，≥99.0%)、磺胺甲恶唑(SMX，≥99.0%)、磺胺二甲基嘧啶(SMZ， ≥99.0%)、甲氧苄胺嘧啶(TMP，≥98.0%)、磺胺甲嘧啶(SMR，≥99.0%)、氯霉素(CAP，≥99.0%)、阿奇霉素(AZM，≥95.0%)、克拉霉素(CTM，≥95.0%)、(红霉素(ETM，≥95.0%)、罗红霉素(RTM，≥90.0%)、泰乐菌素(TYL，≥95.0%)和黄连素(BEB，≥95.0%)均为固体粉末标样，购自美国Sigma Aldrich公司。

　　流动相试剂： 甲醇、甲酸和醋酸铵均为色谱纯(德国Merck公司)，超纯水由Spring 超纯水系统(中国锐思捷科学仪器公司)制备;NaCl和叠氮化钠(NaN3)为分析纯，NaCl在450 ℃焙烧4 h，NaN3用甲醇清洗3次，风干备用;HLB固相萃取柱(200 g/6 L，美国Waters公司)。储备标准溶液的配制：称取适量的抗生素固体标准品(精确到0.01 mg)，溶于10 mL甲醇中，-20 ℃下避光保存。脱水红霉素(ETMh3O)标准溶液用ETM标准溶液制备，制备方法为：在红霉素标准溶液中加入适量稀h3SO4，常温下震荡4～6 h，然后用稀NaOH溶液调节pH至6，定容，4 ℃条件下保存。各个浓度的标准工作溶液由储备标准溶液序列稀释而成，4 ℃条件下避光保存，当天使用。

　　2.2 样品的采集、萃取与浓缩净化

　　在广州市某河涌采集底泥样品，在广州市某污水处理厂采集脱水污泥，样品用锡箔纸包裹，冷冻干燥后保存于-20 ℃冰柜中备用。

　　准确称取0.2 g干燥脱水污泥样品于10 mL离心管中，加入8 mL 50%甲醇溶液(pH 2，1 mmol/L EDTA)，涡旋混匀1 min，超声10 min后，以4000 r/min离心5 min，转移上清液;再分别用8， 5， 5 mL 50%甲醇溶液(pH 2)重复萃取3次，混合所有上清液，摇匀。

　　在USE萃取液中加入400 mL超纯水稀释，使溶液中有机相浓度&<5%。加入2.34 g NaCl，调节pH至4.2。HLB 固相萃取柱在使用前用甲醇、丙酮、高纯水(pH 4.2)顺序淋洗3次，每次2 mL。将脱水污泥萃取液以约3 mL/min流速通过HLB萃取柱，接着，用5%甲醇溶液淋洗萃取柱，真空干燥5 min后，抗生素分析物用5 mL甲醇洗脱。洗脱液在柔和的N2气流下浓缩至0.1 mL，加入内标，用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，经0.2 μm针头过滤器过滤后，进行LCMS/MS分析。

　　2.3 色谱与质谱条件

　　色谱条件： Agilent Zorbax Eclipse XRD C18液相色谱柱(150 mm×3.0 mm×3.5 μm)，柱前接同性质C18预柱(4 mm， phenomenex，美国)，柱温35 ℃，流动相A 为5 mmol/L醋酸铵和0.1%甲酸混合溶液;流动相B为甲醇，流速0.25 mL/ min，进样量5 μL。梯度洗脱： 0～10 min， 10%～30% B; 10～17 min， 30%～50% B; 17～20 min， 50%～80% B; 20～25 min， 80%～100% B; 25～27 min， 100% B。柱平衡时间8 min。

　　质谱条件：电喷雾电离正离子模式(ESI+)，干燥气温度350 ℃，干燥气流速10 L/min，毛细管电压： 4500 V， MS1和MS2温度均为100 ℃，扫描模式：多反应监测(MRM)，每对离子扫描时间为50 ms。

　　 　　3 结果与讨论

　　3.1 LCMS/MS条件

　　比较了甲醇和乙腈为流动相的实验结果显示： 甲醇为流动相时，基线稳定，各分析物分离良好。同时，在流动相中加入适量的醋酸铵可以增强SAs和MLs的保留，并能改善峰形。因而，本研究选择5 mmol/L醋酸铵与0.1%甲酸混合溶液和甲醇作为流动相，大部分抗生素化合物都得以较好分离，峰形良好(图1，A列)。

　　SAs， TMP和MLs均以其[M+H]+准分子离子作母离子。氯霉素的准分子离子响应值很低，本研究采用文献[12]的方法，以m/z 305为母离子。SAs的特征离子为m/z 155.9，是氨基苯磺酸部分[MRNh3]+[13]; MLs的特征离子为m/z 158 ([C8H14O3]基团)，其它主要有[M+2H-C8Hl5O3][14，15] 。各抗生素的特征离子以及其它主要的LCMS/MS参数见表1。

　　3.2 定性与定量分析

　　每种抗生素均选择一组母离子对与一组子离子对进行监测。当样品中检测物的保留时间与标准品一致(即相对偏差&<5%)，并且两个离子对的响应值比例与标准品相对偏差小于20%时，方可确认为目标物。

　　基质效应是环境介质，特别是脱水污泥这种复杂环境中微量痕量有机污染物定量分析常见的难题之一[16]。通常，基质效应可导致分析物信号增减，进而影响定量的准确性和可靠性。本研究采用磺胺甲嘧啶(SMR)为璜胺类抗生素及TMP和CAP的内标; 对于大环类抗生素，则选择与其结构相似的黄连素(BEB)为定量内标。作为内标的SMR和BEB均未曾在我国特征水环境中检测到[6]。内标法的采表1 抗生素化合物的主要LCMS/MS参数*: SAs， TMP和CAP的定量内标(internal standard for SAs， TMP， and CAP);**: MLs的定量内标(internal standard for MLs)。用显著减少了基质效应引起的定量分析的不准确性。为了确定定量结果的重现性，每天2次检测同一个中等浓度(50 μg/L)工作溶液，所有抗生素的日内相对标准偏差均&<4%; 日间(7 d)相对标准偏差&<10%。

　　配制0.1～1000 μg/L工作标准溶液，采用内标定量法，建立每个抗生素的定量校正曲线。各抗生素的线性回归方程和线性范围见表2。以信噪比≥10时各抗生素的浓度为定量检出限，结合回收率以及样品量，脱水污泥和底泥中抗生素的方法定量检出限(MDLs)为2.2～66.9 ng/g(表2)。表2 抗生素的线性范围与方法检出限

　　3.3 萃取以及净化方法的选择与优化

　　取0.2 g脱水污泥样品10份，其中6份分别加入50 μL 10 mg/L 的SAs， TMP和CAP的混合标准溶液，混合均匀后放置2～3 h。在中性条件下， 将2份未加标脱水污泥样品和3份加标脱水污泥样品用V(乙腈)∶V(丙酮)∶V(水)=1∶1∶1(含1 mmol/L EDTA)分别进行超声辅助萃取和加速溶剂萃取。ASE的条件为：萃取温度100 ℃，压力0.1 MPa，预热与静止时间均为3 min，循环萃取3次，最终的溶剂量约为60 mL。结果表明，二者的萃取效率相近(表3)。超声萃取法操作方便，使用溶剂量少，经济易行，因而选择超声萃取为脱水污泥中抗生素的萃取方法。

　　取脱水污泥样品(0.2 g/样品)若干，分成6组，每组设置2个未加标脱水污泥样品和3个加标脱水污泥样品，加标脱水污泥样品制备如前所述。分别在下列6种溶剂(所有溶剂中均含1 mmol/L EDTA)条件下采用USE萃取，比较其萃取效率。a： 50%乙腈溶液，pH=2; b： 50%甲醇溶液，pH=2; c： V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=2∶1∶1，pH=2; d： V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=1∶1∶1，pH=2，e： V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=1∶1∶1，pH=7; f： V(丙酮)∶V(甲醇)∶V(水)=1∶1∶1，pH=2。结果表明，在酸性条件下表3 超声波辅助萃取(USE)与加速溶剂萃取(ASE)的萃取效率比较以50%甲醇溶液为萃取剂，抗生素化合物的回收率为74.7%～111.8%; 相对标准偏差为1.2%～10.6%。氯霉素在所有条件下均表现出良好的萃取率，而SAs在其它条件下萃取率相对偏低。MLs采用50%乙腈溶液在酸性条件下萃取时，回收率均&>60%，但在其它条件下萃取率仍较低(表4)。综合考虑，本研究选择50%甲醇溶液(酸性条件下， pH=2)为萃取剂。此外，EDTA的加入可以降低MLs与样品中金属离子的螯合，提高萃取率[17]。

　　本研究的回收率优于文献[7]中用ASE 和USE的回收率，其主要的原因可能是溶剂种类及pH条件的不同。表4 抗生素在不同萃取条件下的回收率: 平均回收率(average recovery，n=3);黑体表示为最终选择萃取方法的回收率(boldfaces represent recovery of extraction method eventually chosen)。3.5 环境样品分析

　　应用本方法分析了广州市某河涌底泥和污水处理厂脱水污泥中抗生素的含量， 在脱水污泥检测到了SMZ， CTM， ETMh3O和RTM(见图1中C列)， 含量在12.1～43.0 ng/g之间， 相对标准偏差在2.9%～11.5%之间(n=2);在河涌底泥中检测到了SMZ， CTM， ETMh3O， RTM和TMP含量在6.8～125.6 ng/g之间(表5)。表5 抗生素在城市水体淤泥及沉积物中的含量 (ng/g干重)

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