磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展

【摘要】 蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰，在细胞的增值、分化、信号转导以及转录与翻译调控、蛋白质复合体的形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用。因此磷酸化蛋白的鉴定成为翻译后修饰研究的重要内容。但由于磷酸化蛋白的丰度较低， 难以用质谱直接检测。为了解决这个问题，改善质谱对磷酸肽的信号响应， 需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集。本文系统地介绍了磷酸化蛋白组学研究中应用较为广泛和最新建立的各种分离富集方法的原理、特点、应用研究进展，包括抗体富集法、激酶特异富集法、亲和富集法、化学修饰法、多种色谱分离富集方法以及MALDI靶盘富集法。

【关键词】 磷酸化蛋白质组，分离富集方法，评述

　　1 引 言

　　磷酸化是蛋白质翻译后修饰最为重要的形式。据统计， 哺乳动物细胞内的蛋白质有1/3以上可以被磷酸化。 真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸[1]。其中，磷酸化丝氨酸最多，磷酸化苏氨酸次之，而磷酸化酪氨酸最少， 三者的比例是1800∶200∶1。最新实验鉴定到三者在真核细胞的百分比为86.4%、11.8%和1.8%[2]。磷酸化蛋白在细胞信号转导、细胞的分化、增值、周期调控、新陈代谢、转录和翻译、蛋白降解和细胞生存等[3]方面发挥着重要的作用。

　　磷酸化蛋白在细胞生命活动中的重要作用，使其成为蛋白质组学研究的热点。但是磷酸化蛋白自身的一些特点，使得磷酸化蛋白质分析仍是一件很具挑战性的工作。首先，磷酸化蛋白质含量很低，在特定刺激下仅有少部分蛋白发生磷酸化;其次，磷酸化的可变性，使得不同条件下蛋白存在不同的磷酸化形式;再次，现有的分析方法缺乏对磷酸化位点的动态分析，使得部分位点难以鉴定。最后，磷酸酶的存在使得在样品制备过程产生脱磷酸化现象。因此对磷酸化蛋白或者磷酸化肽段进行富集， 提高磷酸肽的相对含量， 成为磷酸化蛋白组学研究中的重要内容。

　　传统分析蛋白质磷酸化的方法是用放射性同位素32P 标记到磷酸化的蛋白质上，带有放射信号的蛋白质可以通过蛋白质的分离， 如二维凝胶或HPLC 分离及Edman 测序等方法，鉴定磷酸化氨基酸类型及位点[4，5] 。这种方法除了具有放射性实验的缺点以外，实验比较耗时并且不能进行高通量的磷酸化蛋白组学分析。近年来， 一些富集方法不断改进及涌现，如抗体法、固相金属离子亲和色谱(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)、金属氧化物/氢氧化物亲和色谱(Metal oxide/hydroxide affinity chromatography， MOAC)、离子交换和等电聚焦、β消除Michael加成反应等。目前各种富集方法与质谱(Mass spectrometry， MS) 技术的结合已成为研究蛋白质磷酸化的主要工具，逐渐取代了传统的磷酸化蛋白质分析方法。本文综述了近年来用于分离富集磷酸化蛋白和肽段的各种方法。

　　2 磷酸化蛋白分离富集方法

　　2.1 抗体富集法

　　富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀， 从复杂混合物中免疫沉淀目标蛋白质。已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗体，其中抗酪氨酸磷酸盐抗体最为常用。免疫沉淀技术对抗体的要求更高，抗磷酸酪氨酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验。磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小， 抗原抗体结合位点有空间障碍， 抗体的结合力较差[6]，所以多年来一直没有用于免疫沉淀分析。

　　Schumacher等[7]利用两种不同的磷酸化酪氨酸抗体对肿瘤细胞系SUDHL1裂解液分别经免疫沉淀和免疫亲和层析富集磷酸化酪氨酸蛋白，经质谱鉴定表明双抗免疫沉淀法可鉴定到更多的磷酸化蛋白。Pandey等[8]用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫沉淀表皮生长因子(EGF)刺激后的 HeLa 细胞总蛋白质和未刺激的 HeLa 细胞总蛋白质，通过MS分析共鉴定出7个已知的 EGF 激酶底物和1个新的 EGF激酶底物Vav2。Chong等[9]也利用磷酸化酪氨酸抗体富集鉴定到3个新的EGF信号通路下游的靶蛋白，并且通过该方法还可对蛋白质相互作用进行研究。Gronborg等[10]对多种商品化的抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体的免疫沉淀性能进行了评价，发现有3个抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体可应用于免疫沉淀，并成功富集了磷酸酶抑制剂 Calyculin A诱导的 HeLa细胞磷酸化蛋白质。

　　2.2 激酶特异富集法

　　很多激酶不仅以相互协同的形式动态调控着信号通路，而且还通过特异位点磷酸化来调控自身以及不同激酶间的功能活性[11]。但是由于激酶相对于其底物来说丰度更低，因此在已有的磷酸化蛋白质组学研究中对于激酶的磷酸化位点的研究尤为不足。免疫沉淀技术可以用于大规模的磷酸化蛋白质组学研究，磷酸化酪氨酸蛋白特异性抗体可以用于磷酸化激酶的富集，但是这些方法不能对激酶进行特异性富集。为了对激酶磷酸化状态进行研究，利用小分子的磷酸激酶抑制剂对其进行特异亲和层析成为激酶磷酸化蛋白质组学研究的重要方法[12]。另外激酶抑制剂与激酶结合蛋白共同富集显著提高了激酶磷酸化蛋白质组学鉴定水平[13]。Godl等[14]首先利用激酶特异富集法对p38 激酶的抑制剂SB 203580的作用底物进行研究，他们利用螯合反应固定了SB 203580的亲和柱富集鉴定的几个未知的激酶底物，并且研究认为： SB 203580对RICK [Riplike interacting caspaselike apoptosisregulatory protein (CLARP) kinase/Rip2/CARDIAK]抑制作用更加灵敏。 Daub等[15]利用激酶抑制剂亲和层析法对周期阻滞到S和M期的HeLa S3细胞系进行了定性及定量研究，他们采用同位素标记的固定培养技术对细胞进行培养。细胞裂解后利用5种不同的激酶抑制剂螯合的3个层析柱进行连续富集，洗脱液混合后进行磷酸化蛋白组学分析，对219个S和M期的磷酸化激酶进行了定量分析，同时鉴定了1000多个激酶上的磷酸化位点，并且鉴定到新的与有丝分裂相关的激酶，在细胞信号通路研究上显示了独特的优势。

　　2.3 亲和富集法

　　目前，一些商品化的试剂盒主要采用磷酸化蛋白亲和富集法。利用磷酸基团与一些金属离子或金属氧化物等的亲和作用，实现对磷酸化蛋白的富集。ProteoExtract Phosphoproteion Capture Kit(MERCK)是一种亲和富集试剂盒，试剂盒提供了磷酸化蛋白富集所需的所有试剂， 每个试剂盒可用于处理25 g哺乳动物组织或1×109个培养细胞。现在运用比较多的磷酸化蛋白富集试剂盒主要是Qiagen公司的PhosphoProtein Purification Kit。PhosphoProtein Purification Kit利用亲和层析技术来分离细胞裂解液中的磷酸化与非磷酸化蛋白，可得到保持有生物活性的蛋白。

　　Li等[16]通过PhosphoProtein Purification Kit对代谢标记和SDF刺激的Jurket细胞裂解液进行富集，后经SDSPAGE分离切取PTEN所在位置附近的5条带进行质谱鉴定，结果鉴定到PTEN蛋白上2个磷酸化位点S和T，并且经生物学实验证明该磷酸化位点对PTEN的功能起着重要的作用。Klemm等[17]利用该方法对永生化小鼠脑毛细血管内皮细胞株(Immortalized rat brain capillary endothelial cells)的磷酸化蛋白进行富集，在经SDSPAGE电泳后，提取肽段进一步利用TiO2富集磷酸化肽段也显示出独特的优势。Chew等[18]在对Drebrin E2在胃粘膜上皮细胞的表达研究中，通过该试剂盒富集后进行质谱鉴定了Drebrin E2的磷酸化位点并对其生物学活性进行了深入研究。

　　除此之外，还有ProteoEnrichTM ATPBindersTM试剂盒(Calbiochem)。该试剂盒仅用于蛋白激酶和其它ATP结合蛋白(ATPbinding proteins，ABPs)的抽提富集。

　　3 磷酸化肽段的分离富集方法

　　3.1 化学修饰法

　　用亲和试剂取代磷酸化肽段上的磷酸集团，再用亲和提取的方法从混合肽段中分离磷酸化肽段，是一种有效的化学修饰法。磷酸化的丝氨酸和苏氨酸在碱性条件下发生β消除反应成为化学修饰富集的重要理论基础[19，20]。β消除磷酸基后产生的双键成为Michael加成反应的受体[21]。研究表明，亲核的巯基可在β消除后的丝氨酸和苏氨酸残基处共价结合完成Michael加成反应，在通过巯基另一端相连的生物素经液相色谱亲和层析，完成对磷酸化蛋白的富集。但是该方法存在灵敏度低、低丰度蛋白易丢失以及小分子磷酸化蛋白难以分析等不足。

　　Tseng等[22]利用上述方法的基本原理，改用Ba(OH)2碱性溶液作为β消除的反应条件，同时对Michael加成供体进行了整合，利用巯基和碘乙酰胺直接共价相连; 碘乙酰胺另一端连接到树脂上，通过固相的Michael加成直接捕获磷酸化肽段到树脂上。非磷酸化肽段及其碎片离子经洗脱除去，磷酸化肽段则形成共价标签接合于树脂上。这样可以在剧烈的条件下进行洗脱，再经酸裂解释放肽段。利用该方法研究认为CDK5催化MAP2和TAM在同一结构域发生磷酸化，还可从鼠脑样品中高特异性的分离磷酸化蛋白。

　　与其它方法相比，该方法具有许多优点：磷酸化位点的标记和肽段的富集在单独的固相树脂上即可完成，减少了样品的丢失，有利于低丰度的富集;碘乙酰胺标签的质量小于生物素标签的质量[23]，这样扩大了肽段富集和分析的范围; 同时，碘乙酰胺标签与肽段共价相连，减少了质谱分析中的中性丢失;研究证明，在β消除中引入Ba(OH)2可有效降低糖肽的消除反应[24]，进一步较少了副反应，提高了分析的特异性。

　　该方法的不足之处是：它仅能用于对磷酸化苏氨酸和磷酸丝氨酸的分析和鉴定，而磷酸化酪氨酸则不发生消除反应。另一种是通过化学反应在磷酸基团上连接1个半胱胺基团 (Cysteamine)，修饰的磷酸肽用固相化的碘乙酰凝胶亲和提取[25]，这种方法可实现各种磷酸氨基酸的取代，，但是肽N端必须首先用 tBoc(Tert2butyloxycarbonyl) 保护; C端则进行酰胺化保护， 以避免杂反应产生。化学修饰法对多磷酸化的肽段的分离效果不佳， 并且存在副反应[26]。

　　3.2 色谱分离富集法

　　3.2.1 IMAC富集法 固相金属离子亲和色谱(Immobilized metal affinity chromatography， IMAC)是最为常用的分离磷酸化肽段的方法。1986年Muszylnska等[27]发现固相化的铁螯合离子对磷蛋白和磷酸化氨基酸有高选择性的结合能力。IMAC方法富集磷酸肽的原理是: 带正电的金属离子， 如Fe3+ [28，29]、Ga3+ [30]、Zr4+ [31]可以与带负电的磷酸基团产生静电交互作用而结合。这种结合能力受到pH 值、离子强度和溶液有机相的影响。在高pH 值或磷酸盐存在的缓冲液中， 金属离子与磷酸基团间的结合被破坏， 磷酸化肽被释放出来。Zhang等[32]利用二维富集策略，先用抗磷酸化酪氨酸抗体富集磷酸化肽段，再经IMAC进一步富集，经LCMS/MS分析鉴定到76个蛋白质上的104个酪氨酸磷酸化位点。

　　在IMAC富集磷酸化肽的过程中，富含酸性氨基酸的肽也能够与金属离子结合造成非特异吸附。为克服酸性基团存在造成的非特异性吸附现象，Ficarro等[33]首先采取甲基化的方法把羧基转化为酯基，经IMAC LCMS/MS 富集鉴定，这样醇类与肽段的C端羧基和天冬氨酸、谷氨酸的羧基发生反应，减少了肽段所带的负电荷，增加了IMAC的特异性。He等[34]利用化学标记和IMAC 的基本原理结合HPLC/MS、HPLC/MS/MS，通过同位素标记的甲醇在无水HCl的反应条件下，酯化磷酸化肽段的酸性羧基，对肺癌腺细胞系NCIH1299细胞的标准培养和血清饥饿条件下的磷酸化蛋白肽段进行了有效的富集、相对定量分析以及磷酸化位点分析。该方法降低了肽段的负电荷水平，通过IMAC特异性亲和分离甲酯化的肽段，减少了IMAC的非特异性吸附，同时也可通过H1和H3标记的甲酯化基团对两种样品进行相对定量分析。但是该方法也存在着不足，残留水的存在可能使天冬氨酸和谷氨酸的发生脱酰胺反应，随后进行甲基化，这样可能造成同1个氨基酸发生两次酯化反应，增加酯化的水平，给分析带来了困难。Ficarro等[33]认为将酯化反应时间缩短在20～40 min之间，可使副反应的发生率减少5%～10%。

　　尽管如此，IMAC方法仍然存在局限性：所获得的大部分生物样品中含有各种试剂，如EDTA和金属盐类以及其它小分子污染物，在利用IMAC进行大规模的磷酸化蛋白质组学研究之前需脱盐纯化。

　　3.2.2 金属氧化物和金属氢氧化物富集方法 TiO2富集法是目前最为成熟的金属氧化物富集法。TiO2在不同的pH值下，可以表现为路易斯酸或路易斯碱。在酸性条件下，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合;在碱性条件下，则表现为路易斯碱，可以与阳离子结合。这样磷酸化肽段的磷酸基在酸性条件下与之结合，碱性条件下洗脱达到富集磷酸化肽段的目的。磷酸盐、羧酸盐和硫酸盐等都与TiO2有高度的亲和力，其中磷酸盐与TiO2的结合能力最高。TiO2为富集材料已经形成了许多富集形式，如MonoTip TiO2、Geloader[35]、磁珠形式[36]、在线连用TiO2色谱柱[37]及TiO2高效色谱柱[38]等。利用各种蛋白酶的裂解作用、TiO2富集法以及灵敏的nano LCMSMS，实现了在fmol水平上的磷酸化位点鉴定。Koshi等[39]利用TiO2富集方法和nanoLCMS/MS在线连用对Hela细胞系进行磷酸化蛋白质组学研究，鉴定到512磷酸化蛋白上的671个磷酸化位点，并且首次建立了TiO2在线富集鉴定复杂样品的磷酸化分析体系。

　　利用TiO2层析柱对磷酸化肽段进行富集，会发生富含酸性氨基酸的磷酸化肽段非特异富集现象。Klemm等[17]研究表明，TiO2优先吸附含酸性基团(Aspartic acid和glutamic acid)和亲水性氨基酸，当酸性氨基酸侧链发生酰基化反应时可降低这种吸附作用。同时最近研究表明通过降低pH值以及加入2，5DHB[40]可有效降低非特异性吸附现象。与 IMAC相比，该方法具有更高的特异性，并且对低pH溶液、去垢剂、盐类、其它低分子污染物有更高的耐受性。

　　除TiO2外，许多金属氧化物和氢氧化物也已经用于磷酸化肽段的富集，如Al2O3、Al(OH)3、ZrO2等。 Li等[41]通过在Fe2O3磁性微球的表面固定Al2O3，利用Al2O3对磷酸化肽段的特异亲和作用实现对磷酸化肽段的富集。该方法不仅有很高的富集能力，并且易于与非磷酸化肽段分离。与Fe3+形式的磁珠以及IMAC方法相比有更高的选择性。Wolschin等[42]也进行了Al(OH)3 对磷酸肽富集能力的研究， 并且在一定的条件下认为Al(OH)3的特异性要高于 Al2O3。

　　Kweon等[43]首先对ZrO2富集磷酸化肽段的效率也进行了研究，利用αcasein和βcasein作为标准品，对TiO2和ZrO2富集方式进行了评价。结果表明，TiO2倾向于富集多磷酸化肽段，而ZrO2则更易于富集单磷酸化肽段;为进一步提高磷酸化的检测水平，两者联合使用可以显著提高磷酸化肽段富集的覆盖率，减少样品的丢失。

　　在酸性条件下，Fe2O3材料表面对磷酸基团具有很强的特异性吸附，这一特性使得Fe2O3可能作为富集分离磷酸化肽段和蛋白的候选载体，单喆等[44]利用介孔氧化铁微球富集分离磷酸化肽段和蛋白，经MALDITOFMS鉴定也取得了理想的富集分离效果。与传统FeIMAC相比，使用介孔Fe2O3的富集分离过程中，消除了反复活化载体、冲洗非磷酸化肽段的步骤，是一种简单、快速、高效分离磷酸化肽段和蛋白的方法。

　　3.2.3 阳离子交换色谱法 阳离子交换色谱法是基于磷酸化肽段与非磷酸化肽段在酸性溶液中所带电荷的不同达到分离的目的。在pH=2.7时，胰蛋白酶的酶切产物大部分带+2 电荷，而磷酸化肽段由于含有磷酸基团，带-1电荷，所以磷酸化肽段在酸性溶液中带+1 电荷。这样在强阳离子交换色谱中，单电荷肽段比多电荷肽段流出时间早。因此，磷酸化肽段便能从多电荷复杂的非磷酸肽中分离富集。

　　Beausoleil等[45] 利用SDSPAGE 和强阳离子交换色谱(Strong cation exchange chromatography，SCX)成功地从 HeLa 细胞中鉴定了967个磷酸化蛋白，2002个磷酸化位点。Sui等[46]利用SCX直接对酵母蛋白质进行了分析，结果显示在直接上样质谱鉴定中未检测到磷酸化肽段，经SCX分离富集后则鉴定到14个磷酸化肽段。单独利用SCX对磷酸化肽段进行分离富集也存在着许多问题，首先该方法只适用于Trypsin 酶切样品;其次是当肽段中含有碱性基团(如含有漏切位点或含有His等)时，磷酸化肽会随着后面的大批非磷酸化肽段一起洗脱，造成磷酸化肽的丢失。

　　目前SCX富集方法与其它方法联用提高了磷酸化肽的富集覆盖率，取得了很好效果。如Trinidad 等[47]将SCX 与IMAC 结合的策略用于磷酸化蛋白富集，结果比单独用任何一个富集方法得到的磷酸化肽段高3倍。Olsen等[48]联合利用强阳离子交换色谱法(SCX)和TiO2进行磷酸化蛋白质组研究，一次鉴定了2400个磷酸化蛋白上的6600个磷酸化位点，该鉴定策略极大地提高了磷酸化位点的鉴定水平，为大规模磷酸化蛋白质组研究提供了保障。

　　3.2.4 阴离子交换色谱法 阴离子交换色谱法与阳离子交换色谱法的基本原理极为相似，也是根据带电荷的不同实现对磷酸化肽段分离富集。磷酸基团的存在使磷酸化肽段比非磷酸化肽段有更强的酸性，酸性增加使其极易与阴离子交换色谱柱结合，对磷酸化肽段有很强的保留能力，从而达到分离富集磷酸化肽段的目的。

　　Han等[49]采用SAX对人肝脏磷酸化蛋白组进行研究，肝脏蛋白肽段经SAX分离后直接进行质谱鉴定，结果鉴定到168个磷酸化蛋白中的274个磷酸化位点，并且与IMAC富集方式相比，通过一定的梯度洗脱，不仅可以实现富集，而且可以分级分离磷酸化肽段。Maor等[50]利用SAX盐梯度洗脱预分离拟南芥蛋白肽段，然后经IMAC进行富集磷酸化肽段对拟南芥进行磷酸化蛋白组研究。结果表明，经SAX后可以有效减少样品的复杂程度，极大提高了IMAC富集效率，提高了磷酸化肽段的鉴定覆盖率。

　　单一的阳离子或阴离子交换色谱法对磷酸化蛋白的鉴定是有限的。采用SAX和SCX连用的方式，可明显提高磷酸化肽段的覆盖率。阴阳多维液相色谱质谱连用系统(YinYang multidimensional LC coupled with MS system)[51]是通过结合阳离子交换层析(SCX)、阴离子交换层析(SAX)以及反相高效液相色谱法(RPHPLC)对肽段混合物进行分离。该方法操作简单，样品用量少，具有极高的分辨率。Dai等[51]利用该方法对1 mg鼠肝样品进行分析，结果在14105个不同的肽段中，鉴定了13256个非磷酸化肽段和包含809个磷酸化位点的849个磷酸化肽段。

　　3.2.5 亲水性相互作用色谱法 亲水性相互作用色谱(Hydrophilic interaction chromatography， HILIC)是1990年提出的，用来描述正相色谱(Normalphase chromatography)。亲水性相互作用色谱中固定相为极性很强的材料，流动相为10%～40%水。根据化合物的亲水性和带电荷基团与固定相之间的氢键和离子键作用进行分离。化合物的极性越强，吸附越强。亲水色谱主要用于分离小分子化合物，如碳水化合物、皂甙、糖及药物代谢物，也用于多肽和蛋白质的分离，但相对较少。亲水色谱用于磷酸化肽的分离富集是其最新应用。

　　磷酸化肽因带有磷酸基团通常具有亲水性及带有电荷，在HILIC中的结合能力比非磷酸化肽段强，因此能够与非磷酸化的肽分开。McNulty等[52]利用亲水色谱柱TSKgel Amide80对Hela细胞系总蛋白酶切产物进行亲水富集，再经反相色谱分离后进行质谱鉴定，鉴定到1000个序列特异的磷酸化肽段，其中700多个为首次鉴定，进一步增加了HeLa细胞磷酸化蛋白数据库。结果也表明，HILIC和RPHPLC具有很好的正交性，不相邻的两个组分中磷酸化肽段的重复性很小。与SCX的方法相比，基于HILIC的分离富集方法具有更高的灵敏度，使得磷酸化组的研究覆盖率更高，更重要的是使用简单，没有脱盐步骤，减少了样品损失。

　　Claudio等[53]也利用HILIC构建了新的多维色谱富集策略，他们利用IMAC、HILIC以及RPLC结合的方式对DNA损伤的酿酒酵母磷酸化蛋白组学进行研究，鉴定到2278个磷酸化蛋白上的8764个独特的磷酸化肽段。该分析策略在大规模深度分析磷酸化蛋白质组学上显示了独特的优势。

　　3.2.6 静电排斥亲水性相互作用色谱法 静电排斥亲水性相互作用色谱(Electrostatic repulsionhydrophilic interaction chromatography，ERLIC)的基本原理是在离子交换色谱中，流动相主要为有机溶剂(如70%已腈)时，即使分析物带有和固定相相同的电荷，也会通过亲水相互作用与固定相结合，这种将静电排斥和亲水相互作用相结合的色谱称为静电排斥亲水性相互作用色谱。ERLIC是最新用于磷酸化肽段分离富集的方法。ERLIC过程中，在pH≤2时，肽段谷氨酸、天冬氨酸以及C端羧基处于非离子化状态，在经过弱阴离子交换柱时由于肽段N端的所带正电荷，使肽段与色谱柱填料存在静电斥力，而磷酸化肽段由于含有负电性的磷酸集团与色谱填料产生静电吸引作用，使磷酸化肽段和非磷酸化肽段得以分离。流动相中加入适量的有机溶剂(约70%已腈)会提高磷酸集团的亲水相互作用，增强色谱柱的对磷酸化肽段的保留能力[54]。与其它富集方式(TiO2或IMAC)不同，该方法在一步实验过程中实现了磷酸化肽段的富集和分级分离。

　　Gan等[55]对ERLIC在磷酸化肽段分离富集中的有效性进行了评价。利用ERLIC和已建立的SCXIMAC两种富集策略对EGF处理的A431细胞系的磷酸化蛋白组学进行研究，结果ERLIC鉴定到17311个磷酸化肽段，而SCXIMAC仅鉴定到4850个磷酸化肽段;但是ERLIC仅鉴定到926个序列特异的磷酸化肽段，而SCXIMAC鉴定到1315个(同一肽段含有不同的磷酸化位点算一个肽段)，而两者仅有12%的磷酸化肽段为共同鉴定，这表明两种富集方法存在较高的互补性。随着ERLIC方法的进一步优化，将在大规模磷酸化蛋白质组的研究中发挥更加重要的作用。

　　3.3 MALDI靶盘富集法

　　传统的富集分析方法中，样品从富集到质谱检测需要多步操作才能完成，有的方法需要对富集的样品进行脱盐，可能导致样品的丢失以及难以对微量样品进行分析。为了满足对磷酸化蛋白的高通量分析以及微量样品的分析，可以采用在线富集后直接质谱鉴定的方法。利用MALDI靶盘可实现直接在线富集检测。首先将微量简单样品点于表面特殊修饰的靶上，在经孵育、洗涤、洗脱、酸化后，加基质直接进行质谱分析[56]。

　　现在已经形成多种表面修饰的靶上富集法，包括TiO2固定于玻璃、不锈钢以及聚合材料的MALDI靶板以及Fe3+复合体固定于金和硅靶表面等。Dunn等[57]研究认为，在这些形式中，靶盘表面聚合poly(2Hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) brushes再衍生化Fenitrilotriacetate (NTA)复合体的形式对磷酸化肽段的选择性更高，特异性更强，并且对于标准品Bcasein检出限可达到15 fmol水平。

　　靶上直接富集法具有其独特的优势，如提高磷酸化肽段的检测覆盖率以及降低检出限，可以进行高通量的研究。但是该方法也存在明显的局限性，该方法只能对相对简单的样品进行分析，对于复杂样品，由于MALDI的测序效果较差，限制了该方法的使用。4 结 语

　　不断建立和优化有效的磷酸化蛋白和肽段的富集方法，在磷酸化蛋白组学研究中发挥了重要作用。但是这些方法对于低丰度磷酸化肽段以及多磷酸化肽段的富集检测能力还是有限的。为进一步提高磷酸化肽段的覆盖率，减低非特异性吸附现象，多种富集方法的联合使用可能成为未来磷酸化蛋白和肽段富集的重要策略。现有的磷酸化修饰研究技术大部分只能定性研究结构性磷酸化位点， 而蛋白质功能的变化通常需借助于瞬时的磷酸化变化。定量技术对于研究磷酸化蛋白在生命活动中的功能也显得更为重要。研究发展一些能与大规模富集磷酸化肽段的技术相兼容的定量技术方法，通过质谱分析实现定性与定量的磷酸化富集以及鉴定方法也将成为新的发展方向。同时随着质谱技术的发展，如电子转移解离(electron transfer dissociation， ETD)技术的应用，大规模高通量鉴定蛋白质磷酸化的能力将越来越强。磷酸化蛋白质组学研究的深入将使人类对于生命体蛋白质磷酸化相关的生理及病理过程会有更为深入的认识。

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