半胱氨酸修饰金电极电化学发光法测定罗红霉素

【摘要】 在裸金电极上制备了L半胱氨酸自组装膜修饰电极(LCysAu/SAM/CME)。考察了联吡啶钌和罗红霉素在此修饰电极上的电化学及其发光行为。结果表明，此修饰电极表现出了很好的电化学活性和电化学发光(ECL)响应。基于罗红霉素的存在可增大了联吡啶钌的发光强度，建立了测定罗红霉素片的电化学发光分析方法。在最佳实验条件下，罗红霉素浓度在1.0×10-7～1.0×10-4 mol/L范围内与其相对发光强度呈线性关系，其线性回归方程为I=2×107C+384.02， r=0.9977; 检出限(S/N=3)为1.0×10-7 mol/L。连续测定1.8×10-5 mol/L罗红霉素10次，发光强度的RSD为1.93% ， 表明此修饰电极具有较好的重现性，并将本方法用于罗红霉素片剂的检测。

【关键词】 L半胱氨酸， 化学修饰电极， 罗红霉素， 联吡啶钌， 电致化学发光

　　1 引 言

　　罗红霉素为第3代红霉素衍生物(结构见图1)，是红霉素A的9位羰基以甲氧基乙氧基甲肟基取代的半合成红霉素，属大环内酯类的抗生素[1]。其抗菌活性及抗菌谱与红霉素相似，但对酸稳定，血药浓度高，因而具有用量小、口服吸收良好、作用时间长、稳定性好等优点。罗红霉素直肠给药可作为治疗慢性细菌性和慢性非细菌性前列腺炎的主要药物[2]。目前，对罗红霉素的测定方法主要有高效液相色谱法[3]和流动注射化学发光法[4]。中国药典(2000年版)测定其含量采用微生物检定法，但该方法操作繁琐， 检验周期长， 影响因素多、实验误差大[5]。文献[6]报道了参考中国药典罗红霉素胶囊的溶出度检测法。文献[7]采用紫外分光光度法测定罗红霉素的含量。但用同一溶剂时，罗红霉素与其分解产物显同一颜色，此法测定罗红霉素的含量可能产生很大的误差，故需要选择适宜的溶剂。因此， 建立罗红霉素分析新方法具有重要的意义。

　　电致化学发光(ECL)是通过电极上直接或间接发生的电化学反应而产生的一种化学发光。它是在化学发光和电化学基础上发展起来的一种分析技术，不但保留了化学发光分析和电化学分析所固有的优点，同时还具有其化学发光反应易于控制、方法更灵敏、更具有选择性、获得更多的化学信息等优点[8，9]。ECL作为一种灵敏度高、选择性好的分析方法，近年来引起人们的广泛关注。目前已报道的ECL物质有联吡啶钌类络合物[10，11]、酰肼类药物[12，13]及多环芳烃类物质[14]。其中作为发光试剂的联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+ 具有水溶性好、试剂稳定、氧化还原可逆、发光效率高、可电化学再生、可进行可逆单电子转移反应及激发态寿命长等优点，在ECL光药物分析应用研究中占有重要地位。

　　目前，关于用电化学发光法测定罗红霉素的报道较少。本实验研究了巯基化合物在金电极表面的自组装及分析应用。通过巯基化合物能够在金电极等金属表面形成SM键，且伸向溶液的有机链会形成有序排列的单分子层结构，因此在结构与功能上自组装膜具有类似生物膜的特性，且稳定性好，在界面化学和生命化学领域具有广泛的应用前景。利用L半胱氨酸(LCys)与金电极的强相互作用，通过SAu键使LCys自组装到金电极的表面，形成LCysAu/SAM/CME，此电极对罗红霉素的氧化具有明显的催化作用。据此，成功地建立了一种罗红霉素的ECL检测新方法。在选定的最佳条件下，联吡啶钌与罗红霉素体系的ECL强度与罗红霉素浓度在1.0×10-7～1.0×10-4 mol/L范围内呈良好的线性关系。本方法简单、线性范围宽、检出限低，同时具有较高的选择性，样品处理简单。本方法应用于罗红霉素片剂的分析，结果满意。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　MPIE型电致化学发光分析系统(西安瑞迈电子科技有限公司); DL60D型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)， CH660B电化学工作站(上海辰华仪器有限公司); 电化学实验采用三电极系统: LCysAu/SAM/CME电极为工作电极， Pt丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极(饱和KCl溶液)。

　　1.00×10-4 mol/L罗红霉素标准储备液(用时现配)：准确称取0.0084 g 罗红霉素(中国药品生物制品检定所)，用20 mL无水乙醇溶解后，用水定容至100 mL棕色容量瓶中，再用超声脱气后冷藏于冰箱中备用; 1.00×10-3 mol/L联吡啶钌(Aldrich公司)储备液：准确称取六水合三(2，2联吡啶)氯化钌0.0374 g，用水溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，用超声脱气后放入冰箱中(4 ℃)保存。实验用水均为二次石英亚沸蒸馏水。

　　2.2 LCysAu/SAM/CME的制备

　　将金电极首先用金相砂纸打磨，再依次用0.5和0.05 μm αA12O3粉在平板玻璃上抛光至镜面，分别于无水乙醇和水中超声洗涤5 min。然后将金电极浸人0.05 mol/L h3SO4 溶液10 min，在1.4～0.4 V范围内进行CV扫描，直至得到稳定和重现的伏安图。随后，固定电位在0.25 V恒电位极化3 min，以彻底消除表面可能存在的金氧化物。再将金电极依次用水和无水乙醇冲洗干净，以高纯氮吹干立即浸入0.02 mmol/L LCys溶液中，在室温下自组装24 h，取出电极，用无水乙醇反复冲洗以除去物理吸附的硫醇，最后用水冲洗，即可制得LCysAu/SAM/CME。

　　2.3 实验方法

　　实验在MPIE型电致ECL工作站上进行。三电极系统; 支持电解质为0.1 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 7.50)，将0.4 mmol/L Ru(bpy)2+3和0.2 mL 0.1 mol/L硼酸盐缓冲液加入电解池，在0.2～1.30 V范围内进行CV扫描，然后记录发光信号作为空白。在上述溶液中加入一定浓度的罗红霉素溶液0.1 mL， 采用相同的方法测定发光信号值。以相对化学发光强度(信号/空白)对罗红霉素定量分析，绘制相对峰高强度与罗红霉素浓度的校准曲线，同时对样品进行分析测定。

　　a. 2.5 mmol/L Ru(bpy)2+3;b. a+0.1 mmol/L 罗红霉素(Roxithromycin) 0.1 mol/L Na2B4O7。发光强度时间实验曲线由MPIE型ECL工作站测定。用工作站检测池下方的光电倍增管来收集待测样品的ECL强度，光电倍增管负高压为850 V。溶液测定前用超声波除气5 min，实验在室温下进行，所有电位值均相对于参比电极Ag/AgCl。

　　3 结果与讨论

　　3.1 Ru(bpy)2+3和罗红霉素的电化学行为

　　分别对80 μL Ru(bpy)2+3，80 μL硼酸盐缓冲溶液(pH 7.5)，80 μL Ru(bpy)2+3+100 μL罗红霉素标准液+80 μL硼酸盐缓冲溶液(pH 7.5)进行CV扫描和正向线性电位扫描。实验结果如图2。图2的a和b分别为联吡啶钌体系和罗红霉素与联吡啶钌共存体系的CV曲线，从图2可见，联吡啶钌只有低的电极电流(曲线a)，而罗红霉素加入后电极电流信号显著增强(曲线b)，由此可知罗红霉素对联吡啶钌的电化学发光有显著的增强作用。

　　3.2 罗红霉素Ru(bpy)2+3体系电化学发光行为

　　考察了Ru(bpy)2+3在LCysAu/SAM/CME电极的ECL行为。联吡啶钌在LCysAu/SAM/CME电极的发光强度比裸金电极明显增大。在相同条件下，在Ru(bpy)2+3体系中加入罗红霉素后，体系的发光强度增大约6倍。说明罗红霉素对Ru(bpy)2+3的发光强度具有增敏作用。

　　3.3 缓冲溶液对ECL强度的影响

　　介质是影响电化学发光的主要因素。关于硼酸盐缓冲溶液对电化学发光的影响已有报道[15]。本实验分别考察了硼酸盐和磷酸盐缓冲溶液对电化学发光信号强度及稳定性的影响，如图3所示。结果表明，以硼酸盐缓冲体系为介质时，罗红霉素增敏的联吡啶钌电化学发光信号与联吡啶钌的空白电化学发光信号的信噪比最大，且重现性较好，最佳浓度为0.1 mol/L。 图3 缓冲溶液体系对ECL强度的影响

　　Fig.3 Effect of pH value of solution on ECL signal

　　a. 磷酸盐缓冲溶液(PBS); b. 硼酸盐缓冲溶液(Borate buffer); v：100 mV/s; 扫描范围(Scan potential): 0.2～1.30 V; 0.1 mol/L Na2B4O7 .考察了pH值在6.5～9.0之间的硼酸盐缓冲体系，得知在pH=6.5时发光较弱;随着pH增大，发光强度逐渐增大，pH= 7.5时达到最大值。由于罗红霉素带有胺基，其氮原子上有一对孤电子，易与质子结合，因此在酸性溶液中会与H+反应形成正离子。pH继续变大时发光强度有所降低，可能是由于溶液中过多的OH-参与在电极上的竞争反应造成高价态联吡啶钌的减少。因此，缓冲体系的pH值太低或太高都不利于电极上Ru(bpy)3+3的产生。实验中选择Na2B4O7(pH=7.5)。

　　3.4 Ru(bpy)2+3浓度的选择

　　考察了在0.1～1.0 mmol/L范围内Ru(bpy)2+3浓度对发光强度的影响。结果表明，随着Ru(bpy)2+3 浓度的增加，ECL强度增大，过大的浓度使噪音也同时增加，因此在保证最佳信噪比的前提下，选择Ru(bpy)2+3浓度为0.4 mmol/L。

　　3.5 共存物质的影响

　　在实验条件下，以测量误差&<5%为标准，考察了共存物质对测定罗红霉素的影响。结果表明: 共存物的允许量(以倍数计)： Na+，K+，CI-，Br-，NO-3，葡萄糖，淀粉(1000); Ca2+，Mg2+，Zn2+，SO2-4(100)，不干扰罗红霉素的测定。

　　3.6 方法的评价

　　在最佳条件下，通过ECL工作站记录不同浓度罗红霉素标准溶液在LCysAu/SAM/CME上的发光强度响应如图4所示，以相对峰高对浓度进行线性回归，罗红霉素浓度在1.0×10-7～1.0×10-4 mol/L范围内与其ECL呈线性关系，线性回归方程为I=2×107C+384.02(r=0.9977)，方法的检出限(S/N=3)为1.0×10-7 mol/L。对1.8×10-5mol/L罗红霉素平行测定5次，其RSD为1.93%。结果表明，体系的重现性好。

　　3.7 样品分析

　　称取10片罗红霉素，放入研钵中研磨粉碎混匀，再称取相当于1片罗红霉素量的样品溶于无水乙醇，过滤后用水定容于100 mL棕色容量瓶中，稀释后在最佳实验条件下进行测定。对1.8×10-5 mol/L 罗红霉素溶液平行测定5次，其RSD为1.93%，表明此体系的重现性很好。

　　在样品中加入标准液进行回收率实验，测得的回收率为95.5%～101.3%。结果表明，本方法可以用于罗红霉素片剂的含量测定。

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