脂组学及其研究进展

　　　　 作者：朱超　胡坪 梁琼麟 王义明 罗国安

【摘要】 脂质的生物功能具有多样性，其代谢与多种疾病的发生、发展密切相关。脂质的分析量化对研究疾病发生机理和诊断治疗，以及医药研发有非常重要的生物学意义。分析技术的快速发展，特别是质谱及其联用技术的运用，促使脂质分析不断完善。脂组学就是对生物样本中脂质的整体分析，是代谢组学的重要组成部分，能够促进代谢组学的发展。本文就脂质的生物功能、脂质分析以及脂组学的研究现状作简要评述。

【关键词】 脂组学，脂质分析，电喷雾离子化质谱，代谢组学，评述

　　1 引 言

　　脂类物质是生物体的能量提供者，参与了大量的生命活动，具有非常重要的生理功能。脂质分子在与其它化合物的相互作用，构成了复杂的代谢过程，对生物体疾病的发生、发展产生重要影响。据报道，很多疾病都与脂代谢紊乱有关，如：糖尿病、肥胖病、老年痴呆症、癌症等[1～6]。因此，生命体中脂类物质及其代谢过程的研究成为疾病发病机理和诊断治疗以及医药研发过程的重点。为了得到生物样本中更为全面的脂质信息，更好地反映生物体内脂类物质的作用机制，并能找到与疾病相关的生物标志物或代谢规律，为疾病的治疗提供科学依据，科学家已经将脂质的整体分析做为了研究的重点。

　　随着生命分析化学的发展，电喷雾离子化质谱(ESIMS)成功地运用到脂质的分析，特别是色谱质谱技术的联用，为脂质的整体分析提供了技术支持，也加速了脂组学的诞生。2003年，Han等[7]正式提出了脂组学(Lipidomics) 的概念，即对生物样本中脂质进行全面的系统分析，并以此为依据推测其它与脂质作用的生物分子的变化，进而揭示脂质在各种生命现象中的重要作用机制。上世纪90年代兴起的代谢组学，是以分析生命体中的所有小分子代谢物为研究内容的。对脂质及其代谢物进行整体分析的脂组学，则可以看作是代谢组学的一个分支，并能够在一定程度上促进代谢组学的发展。

　　目前，脂组学已经受到越来越多科研机构的关注[8]，其中以美国的研究机构最为著名：美国国立综合医学研究所(National lnstitute of general medical sciences， NIGMS)、由王学敏教授领导组建的堪萨斯州立大学脂组学研究中心(Kansas lipdomics research center，KLRC) 和华盛顿大学的ORY课题组;欧洲和亚洲也同样出现了脂组学的研究机构：格拉茨大学、奥地利科学院及格拉茨技术大学等共同成立了格拉茨脂组学研究中心(Lipidomics research center graz，LRCGraz);新加坡国立大学Wenk教授也成立了Lipid Profile课题组。此外，还有很多课题组致力于脂组学与代谢组学的研究。

　　可见，脂组学的研究已经成为众多科研机构研究的热点。本文就脂组学的研究现状作简要评述，并通过了解脂组学与代谢组学等其它组学的关系，对脂组学的发展前景进行了展望。

　　2 脂的分类与生物功能

　　脂质在化学组成和结构上有很大差异，但都有一个共同特性，即：不溶于水而易溶于乙醚、氯仿等非极性溶剂。脂质通常分为真脂和类脂两大类 (如图解1所示)。脂质是组成生物体的重要成分，如磷脂是构成生物膜的重要组分，油脂是机体代谢所需燃料的贮存和运输载体。脂类物质也可为动物机体提供必需的脂肪酸和脂溶性维生素。某些萜类及类固醇类物质如维生素A，D，E，K，胆酸及类固醇激素具有营养、代谢及调节功能。有机体表面的脂类物质有防止机械损伤与热量散发等保护作用。脂类作为细胞的表面物质，与细胞识别、种特异性和组织免疫等有密切关系。对脂质进行分析时应充分了解其化学组成和结构特点，从而确定样本分析的色谱分离条件和质谱条件。

　　3 脂组学及其研究现状

　　3.1 脂组学的研究内容及特点

　　脂组学的研究内容为生物体内的所有脂质分子，并以此为依据推测与脂质作用的生物分子的变化，揭示脂质在各种生命活动中的重要作用机制[7～10]。通过研究脂质提取物， 可获得脂质组 (Lipidome)的信息，了解在特定生理状态下脂质的整体变化。脂组学是代谢组学不可或缺的一部分。脂组学的研究有以下优势：只研究脂质物质及其代谢物，脂质物质在结构上的共同点决定了样品前处理及分析技术平台的搭建较为容易，而且可以借鉴代谢组学的研究方法;脂组学数据库的建立和完善速度较快，并能建立与其它组学的网络联系;脂质组分析的技术平台可用于代谢组学的研究，促进代谢组学发展。

　　3.2 脂组学的研究方法

　　3.2.1 样品制备 脂质主要从细胞、血浆、组织等样品中提取。由于脂质物质在结构上有共同特点，即有极性的头部和非极性的尾部。所以，脂质采用了氯仿和甲醇的混合提取液，能够更好地溶出样本中的脂质物质。Yoo 等[11]将 3 mL的氯仿/甲醇 (1∶2， V/V) 加入 4 mL的细胞悬浮液，然后加入 0.8 mL水，超声 0.5 min，再加入 1 mL氯仿和 1 mL水后 2000×g 离心 5 min，室温静置 30 min，取氯仿层，氮气吹干，进样前采用流动相溶解干物待用。这种脂质提取方法，能够提出血浆、脑组织样品中的总脂[1， 12]。Matyash 等[13]用甲基叔丁酰乙醚(methyltertbutyl ether， MTBE)提取样品中的脂质物质。这种方法简化了富集过程，降低了损失率，不溶于MTBE的杂质在容器底部形成小球，容易离心去除。结果表明，用MTBE提取比脂质提取的“金标准”—— Folch or bligh and dyer recipes效果更好。

　　对于只检测总脂中的部分脂质，固相萃取(SPE) 是一个较好的方法。Persson等[14]发展了利用C18柱和硅胶柱分离萃取肠液中磷脂、中性脂等包含游离脂肪酸的方法。谭力等[15]采用硅胶固相萃取柱萃取可以在短时间内连续处理较多数量的样品，操作简单，重复性好。

　　3.2.2 脂质的检测方法 随着分析技术的不断发展，脂类的分析方法也在不断的改进。总体而言，大部分的分析技术都能用来分析脂质，包括：脂肪酸、磷脂、神经鞘磷脂、甘油三酯和类固醇等。常规的薄层色谱(Thin layer chromatography， TLC)已被分辨率更好的色谱技术所取代。与其它研究方法相比，ESI/MS方法有其自身的特点：样品前处理简单、分辨率高、容易实现自动化，适合对脂质混合物(尤其是磷脂混合物)进行快速、灵敏和高通量的定性定量研究[8， 16，17]。色质联用的引入极大地推动了脂组学的发展，其中的核心技术就是ESI/MS，加上色谱等技术对样品中脂质分离的强化，实现了脂质分离鉴定的高通量、高灵敏度和高效率。多维的质谱技术在脂组学的研究中也取得了新的进展[18]。

　　气相色谱质谱联用(GCMS) 适合检测分子量小于500 Da的所有种类脂质分子。利用GCTOF技术平台中的BinBase 和 SetupX，能够一次性得到800种脂质类化合物中的80种物质的半定量结果，并可根据FiehnLib的质谱数据库验证结果的可靠性[19]。

　　用于脂质分析的液质联用技术主要包括：高效液相色谱芯片质谱联用 (High performance liquid chromatographychip/Mass spectrum， HPLCChip/MS)，超高效液相色谱质谱联用 (Ultraperformance liquid chromatographyMass spectrum， UPLC/MS)，超高效液相色谱质傅立叶变换质谱联用(Ultraperformance liquid chromatography/fourier transformMass spectrum， UPLC/FTMS)，液相色谱飞行时间质谱联用(Liquid ChromatographyTime of Flight/Mass Spectrum， LCTOF/MS)。质荷比为100～2000的脂质轮廓都可以通过液质联用方法得到。色谱技术可以使血浆或组织样品中的干扰得到较好地分离，但会延长分析时间，并对流动相有一定要求。Pang等[1]建立了正相液相色谱/飞行时间质谱分析血浆中脑磷脂(Glycerophosphoehtanolamine， PE)， 磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol， PG)， 磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol， PI)， 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine， PS)， 磷酸卵磷酯 (Phosphatidylcholine， PC)， 鞘磷脂 (Sphingomyelin， SM) 和 溶血磷脂胆碱 (Lyso phosphatidylcholine， LysoPC)等7大类磷脂的方法，定量分析正常人、糖尿病、糖尿病和肾病不同分期患者血浆样品中7类磷脂，并发现了7类磷脂在糖尿病和肾病患者不同分期阶段的变化规律，为糖尿病和肾病患者磷脂代谢研究提供了有效可靠的办法。

　　nano ESIFT/MS是基于芯片技术的电喷雾傅立叶转换质谱(Nano electrospray fourier transform/Mass spectrum)，用于脂质的快速分类、半定量、结构鉴定以及脂质指纹图谱的建立。利用NanoMate 芯片与高分辨率的傅立叶变换质谱FTMS或Orbitrap 技术可以在1 min内快速得到血浆和组织 (植物、人类、细菌等) 的粗提物中脂质的轮廓。Kraft等[20]建立了nano ESIFT MS对脂膜进行分析的新方法，能在纳米水平上测定膜上不同脂质的分布，从而获得“脂质膜相结构”的信息。大多数膜的脂质分子组成是类似的，平均只有20%的偏差。这种差别是由膜上脂质分子的分类机制决定的。Schneiter等[21]利用nanoESIMS/MS研究了酿酒酵母膜的脂质分子组成，发现基于酰基链分类机制维持了酵母细胞膜脂质分子种类的组成。Holz等[22]同时定性和定量了视网膜色素细胞中的脂褐素(Lipofuscin， LF)，定量结果表明，LF的含量随着年龄的增长与视网膜病情的严重程度升高，脂质分子组成的改变会影响脂质代谢以及脂质物质整体的深层变化。该方法为视网膜疾病发病机制的研究提供了重要的技术支持。

　　3.2.3 脂组学研究的相关数据库 随着脂组学的迅速发展过程，相关数据库也逐步建立。现有数据库能够查询脂质物质结构、质谱信息、分类及实验设计、实验信息等，其功能也越来越完善。数据库的建立无疑成为推动脂组学自身发展的良好工具。最大的数据库LIPID Maps，是由美国国立综合医学研究机构(National institute of general medical sciences， NIGMS)组织构建的。它包含了脂质分子的结构信息、质谱信息、分类信息、实验设计等。数据库中除了游离脂肪酸、胆固醇、甘油三酯、磷脂等8000余种单一脂质的结构信息外，还包括了81个大类、276个亚类脂质化合物的结构信息。除此之外，不少国家和科研团队也建立了自己的数据库 (脂组学数据库如表1所示)。表1 脂组学研究应用的数据库

　　3.3 脂组学的研究现状

　　3.3.1 脂组学在医药研发中的应用 近年来，研究者对脂质的研究兴趣重新被激活，质谱技术的应用也使脂组学的发展日趋迅猛。脂质是生物事件从膜运输到代谢信号最基本的因子。脂质代谢的扰动与代谢紊乱和疾病的发展密切相关[6]。由于这些扰动可能发生在分子水平，全面解决复杂脂质的量化问题变得非常必要。随着液相色谱质谱联用技术的不断发展，基于四级杆飞行时间杂交质谱仪 (QSTAR Pulsar) 的鸟枪脂组学已使复杂分子构成的脂质的同时定性与定量分析成为可能[23～25]。Ejsing等[26]得到了微量样本的总脂提取物中数百种脂质分子的定量轮廓。这一成果在实验室研究和制药行业中，特别是在生物标志物和药物发现过程领域引起了极大的兴趣，更高通量的实验结果是可以预见的。高通量、半自动化的方法学的新发展已经开始倾向于鸟枪脂组学的研究。机器人辅助样本制备显著提高了数据自动解释的效率，并能够在数据质量没有任何损失的情况下完成大量样本的分析。随着鸟枪脂组学的不断发展，丰度相当小的脂质分子的定量测定也是可以实现的。更多的脂质轮廓的建立会加强磷脂在细胞膜和代谢功能障碍中特殊作用的解释。这将有利于发现具有更好选择性和非毒性的药物靶点。Su等[2]发现糖尿病鼠心肌细胞内钙不依赖性磷脂酶A2(iPLA2)的表达对心肌缺血或心律不齐有重要影响。通过模拟和优化与iPLA2特异结合的脂质分子结构，有望找到一种有效的以iPLA2为靶蛋白的治疗糖尿病、心肌炎的新药。脂组学还能作为评价药物疗效的一个辅助手段。Huang等[27， 28]研究了甲基硝基亚硝基肌(NmethylNnitroNnitrosoguanidine， MNNG) 对SM的作用，发现MNNG不但能引起SM代谢的变化，而且SM代谢相关的关键酶——酸性鞘磷脂酶出现由分散到集中于脂筏的趋势。因此，逆转脂代谢紊乱有利于疾病的治疗，监测药物作用后机体内脂代谢变化情况，及时反应机体生理生化状态的改变，有助于评价药物的药效及确定可能的副作用。

　　目前所面临的挑战则是精确找到脂质分子结构定义上的作用位点，精确指定每个不饱和脂肪酸双键的位置，并对这些脂质进行高通量的量化。Thomas等[29]证实臭氧诱导解离技术 (Ozoneinduced dissociation technology， OzID) 与鸟枪脂组学的整合应用是非常有前途的。因此，高通量的鸟枪脂组学具有巨大的潜力，并会在细胞生物学、分子医学、药物发现和生物标志物的诊断方面发挥关键作用。

　　3.3.2 脂生物标志物的发现 随着分析技术的不断进步，有关低丰度的脂质分子分析与量化的方法已多有报道。运用这些方法，代谢综合症和其它脂质相关的疾病的生化机制得到明确阐释。更重要的是，对疾病发生发展过程中脂质生物标志物的发现有重要意义[30]。Brugger等[31]借助质谱方法详细分析了HIV与其宿主的膜脂组的差异，发现病毒富集二氢鞘磷脂(Dihydrosphingomyelin)，而且当抑制宿主细胞的鞘脂质合成途径后，传染率明显下降，由此推断这类脂质在HIV复制循环中起关键作用。通过系统研究病原体的脂质组，还能有效地确定在宿主病原体交互作用时起作用的脂质，进而找到相关的致病途径。Han等[32]运用脂质组学方法分析糖尿病鼠心肌线粒体膜脂急剧减少的细节，指出心肌磷脂及其直接的代谢前体(Phosphatidylglycerol， PG) 在糖尿病人并发心肌病时起关键作用，并以此为依据，提出了糖尿病心肌病在发病学上的一种可能代谢紊乱机制。

　　3.3.3 脂组学在疾病诊断中的应用 发现疾病相关的诊断指标是进行疾病诊断的关键。脂组学所提供的方法能够监测疾病患者与正常人之间的脂质的变化，从其中找到差异较大的脂质化合物，作为疾病早期诊断的指标。Gadomska等[33]定量研究了4例健康的年纪相符的女性、64例卵巢癌患者和27例良性卵巢肿瘤患者血清中各种胆固醇及脂蛋白的含量变化。结果表明：以载脂蛋白AI (aPoAI) 和游离胆固醇 (FC) 为诊断指标排除卵巢瘤的正确率高达95.5%，综合aPoAI，FC，高密度脂蛋白游离胆固醇 (HDLFC)、高密度脂蛋白总胆固醇 (HDLTC)、载脂蛋白B (aPoB) 及高密度脂蛋白3 (HDL3) 片断诊断卵巢癌的准确率达到97%。另有研究报道溶血磷脂酸在卵巢癌的诊断中表现出高度的敏感性和特异性，能够作为早期诊断卵巢癌及术后随访的生物学指标[34]。

　　4 脂组学与代谢组学的关系

　　代谢组学与蛋白组学、基因组学和转录组学相互关联共同组成整体的系统生物学。组学的研究是以物质组为基础的研究，是考察“系统”与“系统”的相互作用[35]。代谢组学则是研究生物体内所有小分子代谢产物的一门学科，现在已经派生出了糖组学、毒素组学和其它一些以单一化学物质组为研究对象的分支，脂组学也是其中的成员之一 (如图解2所示)。脂组学通过研究脂质提取物，可以获得脂质组(Lipidome) 的信息，它反映了在特定生理状态下脂质的整体变化。研究生物体在正常状态和疾病状态下脂代谢的整体差异，识别疾病脂生物标志物，结合相关酶的研究，就有可能深入地研究代谢途径或致病机制，最终发展出有效的诊断和治疗手段。

　　Scheme 2 Relationship between lipidomics and metabonomics代谢物是生理活动中基因水平和蛋白质水平调控的终端体现。因此，脂组学作为代谢组学的分支能与基因组学及蛋白质组学相互结合， 对生物现象进行不同层次的分析，加深对生命本质的了解。脂组学可以借鉴代谢组学技术的整合运用[36]，增加脂质分析中的信息含量，通过多维的数据处理，建立其与蛋白质组学、基因组学的数据网络关系。van Helemond等[37]结合蛋白质组学和脂组学对血吸虫外壳膜的成分进行分析，确定了血吸虫在进行养分摄取和免疫逃避时起作用的外壳上的蛋白质和脂质，研究发现血吸虫外壳富集宿主缺乏的脂质，而且外壳上富集的蛋白质也与数据库内其它物种表现的蛋白质不同，这意味着可能是这些特殊的蛋白质和脂质造成了外壳的独特功能。但是，研究这些特殊蛋白的功能特征依然存在很大的挑战，需要借助基因组学中的RNAi “击倒” (RNAinterference“knock down”)技术[38， 39]，对其进行表型鉴定，从而阐释特异蛋白和脂质的功能。因此，脂组学、蛋白质组学、基因组学的结合能够更好地阐释化合物在生物体内的功能及作用机制。

　　5 展 望

　　脂组学自诞生以来发展迅猛，已经在细胞生物学、疾病诊断、疾病生物标志物的发现及医药研发等方面取得了相应的进展。但由于起步晚，其仍处于一个早期发展阶段，存在许多机遇和挑战。由于脂质种类繁多，相互作用复杂，现有的分析技术不能同时将生物样本中的脂质完全检测出来。但是，脂组学所表现出来的巨大潜力不容忽视，特别是鸟枪脂组学的迅猛发展，加快了复杂脂质分子的定性和高通量量化等问题的解决。随着分析技术的不断发展，脂质分析会登上一个新的台阶，人们对脂质的结构及作用机制的认识将逐步加深，也将为遗传和细胞生物学发现新的脂质分子的作用机制提供可能的手段。此外，脂组学数据库的建立和完善对脂组学的研究将起到非常大的促进作用。

　　近年来，代谢组学、蛋白质组学、基因组学等技术的不断发展对脂组学的研究起到了积极的带动作用。脂组学与其它组学的整合不但为生物体中脂脂、脂蛋白质及相关基因调控的相互作用提供数据支持，不断完善着生物体的代谢网络，为寻找致病机制及与其相关的潜在生物标志物提供新的手段，也为毒理学研究提供崭新视角。可以说，脂组学与蛋白组学、基因组学的整合运用将增加脂质研究的数据信息，为药物研发、发现生物标志物的临床前和早期临床阶段了解脂质功能提供了新的契机[40]。要充分发挥代谢组学研究的优势，从脂代谢水平研究疾病的发生、发展过程的变化规律，寻找疾病相关的脂生物标志物，进一步提高疾病的诊断效率，并为疾病的治疗提供更为可靠的依据。脂组学能够在一定程度上促进代谢组学的发展，并通过代谢组学技术的整合运用建立与其它组学之间的关系，最终实现系统生物学的整体进步。

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