浊点萃取异辛烷反萃取气相色谱测定茶叶中拟除虫菊酯农药残留

　　　　 作者：莫小荣 郑春慧 陈建伟 赵道远 杨明敏

【摘要】 建立了浊点萃取异辛烷反萃取气相色谱(ECD)检测茶叶中联苯菊酯(Bifenthrin)、甲氰菊酯(Fenpropathrin)、功夫菊酯(Cyhalothrin)、氯菊酯(Permethrin)、氰戊菊酯(Fenvalerate)、溴氰菊酯(Deltamethrin)6种拟除虫菊酯农药残留的方法。对含1.2%(m/V)聚乙二醇6000(PEG6000)表面活性剂和40%(m/V)(NH4)2SO4的6种拟除虫菊酯溶液进行加热萃取，所获得的富集相用异辛烷超声反萃取，并经离心对上层异辛烷溶液进行进一步净化处理，即可获得富集倍数达75倍的6种农药。本方法的检出限(LOD)为：联苯菊酯、甲氰菊酯和功夫菊酯0.4 μg/kg;氰戊菊酯2.1 μg/kg;氯菊酯和溴氰菊酯3.0 μg/kg;用本方法测定了新鲜茶叶中6种拟除虫菊酯农药，含量分别为4.17， 4.15， 4.09， 4.01， 3.93和3.51 μg/kg。在上述茶叶样品中添加20 μg/kg 的6种农药后测定，添加回收率为72.3%～85.6%; 相对标准偏差为2.2%～5.6%。

【关键词】 浊点萃取，反萃取，气相色谱，拟除虫菊酯农药，茶叶

　　1 引 言

　　茶叶中拟除虫菊酯类农药残留检测方法主要有气相色谱法(GC)[1～4]和液相色谱法(HPLC)[5，6]。茶叶成分复杂，在检测前需要进行有效的前处理。其前处理方法主要有固相萃取法(SPE)[7]、固相微萃取法(SPME)[8]、超声波提取法[6]、微波辅助萃取法(MAE)[9]和基质固相分散法(MSPD)[10]等。这些方法耗时繁琐。浊点萃取(cloud point extraction， CPE)在某些方面可以代替上述萃取方法。浊点萃取常用于液相色谱分析前有机样品的前处理[11～14]，其优点是基本不使用非水溶剂，操作方便，但是在分析过程中常需要解决胶束富集相的粘性、表面活性剂在固定相上吸附、表面活性剂本身在紫外区的背景干扰及表面活性剂易堵塞气相色谱柱等问题，所以浊点萃取方法不能与气相色谱直接联用。为了解决此问题，Sikalos等[15]用反萃取方法从浊点萃取的富集相中反萃取6种多联芳烃(PAHs); Jia等[16]也用同样方法从人尿中反萃取有机磷农药; Zygoura等[17]用浊点萃取反萃取方法富集了增塑剂。由此可见，由于采用了反萃取方法， 进一步浓缩了样品，被分析物质的检出限大为降低。

　　本实验采用浊点萃取方法萃取了茶叶样品中6种拟除虫菊酯农药，然后用异辛烷反萃取，使原富集相体积从0.5 mL减少到0.2 mL。再用高灵敏的电子捕获器检测，与浊点萃取后用液相色谱直接检测相比，甲氰菊酯、溴氰菊酯、功夫菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和联苯菊酯的检出限分别从2.7， 10.2， 2.3， 7.7， 9.8， 2.5 μg/kg下降到0.4， 3.0， 0.4， 2.1， 3.0， 0.4 μg/kg。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　6820 气相色谱仪(美国Agilent公司)，配有ECD检测器;色谱工作站SrAdV色谱数据处理系统(上海军锐信息技术开发有限公司);KQ 3200E超声仪(昆山市超声仪器有限公司);Anke TDL60B离心机(上海安亭科学仪器厂制造);HHS26S数显恒温水浴锅(江苏通州试验仪器厂)。

　　甲氰菊酯(92.4%)、溴氰菊酯(98.8%)、功夫菊酯(95.0%)、氰戊菊酯(96.5%)、氯菊酯(94.0%)和联苯菊酯(90.0%)均由江苏省农药研究所提供.分别称取6种农药各0.1 g，用乙腈溶解，配制成1000 mg/L的标准储备液Ⅰ，用于浊点萃取过程条件研究;同样称取6种农药各0.1g，用异辛烷溶解，配制成1000 mg/L标准储备液Ⅱ，用于气相色谱定量分析。上述储备液在冰箱中保存(4 ℃)，根据实验需要稀释至不同浓度。聚乙二醇6000(PEG6000)，配制成20%(m/V)的水溶液;(NH4)2SO4为分析纯;乙腈和异辛烷均为色谱纯，8%(V/V)乙腈水溶液，实验用水均为二次重蒸水。

　　2.2 浊点萃取反萃取实验步骤

　　用8%(V/V)乙腈水溶液将标准储备液Ⅰ稀释到0.01 mg/L后，取10 mL于20 mL刻度试管中，加入0.9 mL 20%(m/V)PEG6000和6.0 g (NH4)2SO4，待(NH4)2SO4完全溶解后再用8%(V/V)乙腈水溶液定容至15 mL，置于30 ℃水浴中保持30 min，最后以3500 r/min转速离心10 min。用长细针头的注射器吸出水相后，剩余的富集相体积&<0.5 mL，用蒸馏水稀释至0.5 mL后，加入0.2 mL异辛烷，超声25 min，取上层异辛烷相1 μL进气相色谱检测。在浊点萃取反萃取过程中，溶液相当于富集了75倍。

　　2.3 样品处理

　　称取1.0 g已粉碎的市售茶叶样品于20 mL刻度试管中，加入1.5 g (NH4)2SO4和5.0 mL 8%(V/V)乙腈水溶液，充分振荡摇匀后置于超声波清洗仪中，超声60 min，过滤后，用6.0 mL 8%(V/V)乙腈水溶液分3次冲洗残渣并过滤，滤液置于离心管中，依次往离心管中加入0.9 mL 20% PEG6000和4.5 g (NH4)2SO4，用8%(V/V)乙腈水溶液定容至15 mL，使PEG6000、乙腈和(NH4)2SO4的最终浓度分别为1.2%(m/V)、8%(V/V)和40%(m/V)。然后按2.2项步骤处理。

　　2.4 色谱条件

　　HP5石英毛细管柱(30 m×0.32 mm， 0.25 μm); 高纯氮气(&>99.999%)为载气;进样口温度280 ℃;检测器温度300 ℃;柱升温程序：起始温度90 ℃，恒温1 min后以20 ℃/min升温至210 ℃; 恒温1 min后再以3 ℃/min的速率升温至280 ℃，恒温3 min后再以10 ℃/min的速率升温至310 ℃; 恒温10 min待测样品组分全部流出;进样方式：分流进样，分流比2∶8;进样量为1 μL。

　　3 结果与讨论

　　3.1 色谱分离条件的选择

　　考察了不同的程序升温条件下6种农药标准溶液的分离情况。结果表明，采用2.4项的程序升温条件时，6种农药都能较好的分离。 图1 6种农药色谱图(a)，茶叶空白(b)和加标茶叶样品色谱图(c)

　　1. 联苯菊酯(bifenthrin); 2. 甲氰菊酯(fenpropathrin); 3. 功夫菊酯(cyhalothrin); 4. 氯菊酯(permethrin); 5. 氰戊菊酯(fenvalerate); 6. 溴氰菊酯(deltamethrin)。按2.3项样品处理方法分别对不含以上农药的茶叶和添加标准农药(添加浓度0.01 mg/L)的茶叶，其色谱图如图1。从图1 可见，茶叶基体对这6种农药色谱分析无影响。

　　3.2 浊点萃取条件的选择

　　3.2.1 表面活性剂种类和浓度的选择 研究了表面活性剂Tween20、TX100和PEG6000为萃取剂时6种农药的回收率。结果发现，Tween20和TX100为萃取剂时，平衡温度均需达50 ℃以上，回收率较低;PEG6000为萃取剂时，平衡温度较低，萃取效果好，故选用PEG6000为萃取剂。以PEG6000为浊点萃取的表面活性剂，当其浓度为0.2%～1.2%(m/V)时，各农药的回收率增大;当其浓度再增大，对回收率基本没有影响(图2)，但增大了表面活性剂富集相的体积会降低富集倍数。本实验PEG6000的浓度选择为1.2%(m/V)。

　　3.2.2 盐浓度的选择 电解质的加入可加快相分离行为，并且降低浊点，(NH4)2SO4易溶解，而且它的加入使聚乙二醇6000体系在室温下即能够完成相分离。(NH4)2SO4浓度增加，萃取回收率增大，当(NH4)2SO4浓度达到40%(m/V)时回收率最好，此时溶液接近饱和，再增加(NH4)2SO4的浓度对回收率无影响(图3)。故实验中所用(NH4)2SO4的浓度为40%(m/V)。

　　3.2.3 平衡时间的选择 实验探讨了不同平衡时间对浊点萃取的影响，浊点萃取体系在30 ℃水浴中分别保持10～70 min。实验表明，当平衡时间为30 min时，各个农药的回收率达到最大; 但当平衡时间过长，会导致浊点萃取向相反方向变化，表面活性剂相逐渐消失。在两相完全分离的情况下，平衡30 min即可。为使富集相和稀释相分层清晰，两相分离后以3500 r/min离心10 min。 图4 温度对6种农药萃取回收率影响

　　3.2.4 平衡温度的选择 温度对于表面活性剂胶束的性质，尤其是分相后形成的凝聚相体积和含水量均有较大的影响。样品按照前面优化条件处理后，在20， 30， 40， 50和60 ℃水浴中分别平衡30 min。实验表明(图4); 从20～30 ℃所有农药回收率上升; 30～40 ℃联苯菊酯、氯菊酯和甲氰菊酯回收率基本不变; 但温度高于40 ℃后回收率下降。而功夫菊酯、溴氰菊酯和氰戊菊酯在30 ℃后回收率下降。故本实验采用的浊点萃取温度为30 ℃。

　　3.3 异辛烷反萃取条件的选择

　　按3.2条件分成清晰两相的体系，用长注射针从下层移去稀释相后加入水不互溶溶剂进行反萃取。正己烷和氯仿也可以用于反萃取，但是正己烷和氯仿具有强的挥发性，超声反萃取过程易挥发导致结果重现性差。故选择异辛烷作为反萃取剂[15～17]。

　3.3.1 异辛烷反萃取体积选择 考察了异辛烷的体积对回收率的影响，异辛烷体积为0.1～0.15 mL时，虽然被测组分富集倍数高，但体积小表面活性剂浓度大，并给转移异辛烷离心净化带来不便，检测重现性差;异辛烷体积过大，被测组分富集倍数越小;当异辛烷体积为0.2～0.3 mL时，即可获得满意结果。故选择0.2 mL异辛烷进行反萃取。

　　3.3.2 超声时间对反萃取效率的影响 超声能加快被测组分从表面活性剂相中转移到异辛烷中，为防止异辛烷挥发，在封闭状态下进行超声。图5显示反萃取效率随超声时间增加而增加。当超声25 min时，异辛烷的萃取效率最高。

　　3.3.3 离心净化 经超声分离后的异辛烷表面活性剂富集相界面不清晰，为净化异辛烷相，将上层异辛烷小心移到1.5 mL离心管中，以6000 r/min离心3 min后，取上层清液进样。

　　3.4 线性关系、检出限、线性范围

　　取不同浓度的6种拟除虫菊酯类农药标准溶液按照2.4项的色谱条件分别进样，确定它们的定量范围和检出限。为了与高效液相色谱法比较，将按步骤2.2取得的表面活性剂富集相直接注入HPLC系统，得到的检出限列入表1。从表1可见，反萃取法检出限比HPLC方法下降了2.3～5.8倍。表1 浊点萃取反萃取法的各种分析数据

　　3.5 回收率与精密度

　　在1.00 g空白茶样里分别添加3种不同浓度(0.01， 0.05和0.1 mg/kg)的混合标准溶液各1.0 mL，充分混匀后测定5次，结果见表2。表2 浊点萃取反萃取法添加回收率

　　3.6 样品检测

　　将浓度约50 μg/kg的6种农药的混合溶液喷洒在未喷洒过农药的新鲜茶叶上，2 h后采集;取风干后(剪碎)的新鲜茶叶1.00 g于20 mL刻度试管中，添加浓度为20 μg/kg的6种农药混合标准溶液1.0 mL，以本方法进行检测，结果见表3。

　　4 结 论

　　采用浊点萃取异辛烷反萃取气相色谱法测定茶叶中多种除虫菊酯农药残留，能显著提高检测灵敏度，并能满足欧盟对茶叶制定农药最高残留限量(MRLs)的要求(如欧盟规定茶叶中一些农药的MRLs 为：甲氰菊酯0.02 mg/kg、溴氰菊酯为5 mg/kg、功夫菊酯为0.1 mg/kg、氰戊菊酯为0.05 mg/kg、氯菊酯为0.1 mg/kg、联苯菊酯为5 mg/kg等);本方法可用于进出口茶叶中上述6种农药残留的检测。

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