高效毛细管电泳测定鸡蛋中三聚氰胺

　　　　 作者：饶钦雄 童敬　郭平李海燕 李晓薇 丁双阳

【摘要】 建立了高效毛细管电泳二极管阵列检测器检测鸡蛋中三聚氰胺的方法。样品用三氯乙酸提取，固相萃取小柱净化处理后进行检测，以50 mmol/L甲酸50 mmol/L甲酸铵(pH 2.5)为缓冲溶液，在总长度为58.5 cm，内径为75 μm的毛细管中，分离时间约6 min，测得的定量限为0.25 mg/kg。三聚氰胺浓度在0.25～5.0 mg/kg范围内进行添加回收实验，平均回收率为80.2%～90.7%，相对标准偏差(RSD)为1.7%～3.4%。本方法简单易行、高效快速、经济环保，可以满足检测需要。

【关键词】 高效毛细管电泳，三聚氰胺，鸡蛋

　1 引 言

　　从2007年美国首发的“宠物毒粮”风波，到2008年的“三鹿奶粉”事件，三聚氰胺已经引起了广泛关注。三聚氰胺，又称氰尿酰胺(在高温下可能分解为氰化物)，是生产塑料树脂的原料，分子中含有大量氮元素，不法分子为片面追求个人利益而将这种与食品毫不相干的工业原料引入食品中，对人们的健康造成严重威胁[1]。鸡蛋是日常食用最多的食品之一，为保障鸡蛋的食用安全，农业部最新颁布的鸡蛋中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg。建立鸡蛋中三聚氰胺残留的检测方法是十分必要。

　　目前，检测三聚氰胺的方法主要有液相色谱法[2～5]、液相色谱质谱联用法[6～8]和气相色谱质谱联用法[9，10]，其检测样品多为饲料，鸡蛋中三聚氰胺的检测方法的报道较少。杨水平等[11]报道了鸡蛋中三聚氰胺的表面解吸常压化学电离串联质谱法成像。毛细管电泳是近十几年发展起来的分离技术，具有高效快速、灵敏度高、自动化高、经济环保等优点，已成为生物化学和分析化学领域中发展最快的一种分离分析技术。本研究建立了鸡蛋中三聚氰胺的毛细管电泳检测方法，操作简便、分析快速、稳定可靠且经济环保，可作为鸡蛋样品中三聚氰胺测定的初筛方法。如果与质谱或电化学检测器联用，可以获得更高的灵敏度。

2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　HP3D高效毛细管电泳仪(德国Agilent公司)配二极管阵列检测器;拓展光程毛细管柱(总长64.5 cm，有效长度56 cm，内径75 μm，德国Agilent公司);Waters Oasis MCX固相萃取小柱(3 mL，60 mg);Effendorf 5804高速冷冻离心机(德国Effendorf公司); Sartorius PB21 pH计(德国Sartourius公司)。电泳缓冲溶液： 50 mmol/L甲酸50 mmol/L甲酸铵(pH 2.5，色谱纯);三聚氰胺标准品(纯度&>99%，Sigma公司)，用V(20%甲醇)∶V(水)=2∶8混合液溶解成500 mg/L储备液;三氯乙酸、甲醇等其它试剂均为分析纯;实验用水均为超纯水。

　　2.2 鸡蛋样品的前处理

　　生鸡蛋全蛋搅拌均匀，准确称取2.0 g，加入20 mL 2%三氯乙酸溶液，超声10 min、 振荡10 min后，以9000 r/min离心5 min，上清液过固相萃取小柱(SPE， 预先用3 mL甲醇和3 mL水活化小柱)，自然流干后分别用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽干SPE柱，用5 mL 5%氨化甲醇(V/V)洗脱。洗脱液在50 ℃用N2吹干，以500 μL 20%甲醇h3O复溶，滤膜过滤后上机检测。

　　熟鸡蛋用匀浆机充分匀浆后准确称取2.0 g，其余处理过程同生鸡蛋。

　　2.3 实验方法

　　毛细管电泳运行电压25 kV;0.35 kPa×8 s进样;检测波长232 nm;温度25 ℃。为提高分析的重现性，毛细管在进样前用运行缓冲溶液冲洗20 min; 进样间用缓冲溶液冲洗3 min; 测定结束用0.1 mol/L NaOH 冲洗5 min，超纯水冲洗10 min。

　　三聚氰胺储备液用20%甲醇水依次配制成1、 5、 10、 20、 40、 80和100 mg/L工作液，每个浓度进样3次，以分析物的峰面积和浓度建立校准曲线。

3 结果与讨论

　　3.1 分离缓冲溶液的优化

　　对柠檬酸柠檬酸三钠、甲酸甲酸铵、Tris碱盐酸、乙酸乙酸铵和磷酸盐5种缓冲溶液进行比较。结果表明，分析物在后2种缓冲溶液中峰展宽;在前3种体系中响应高、峰形好; 但在Tris缓冲体系中信号不稳定; 而柠檬酸根因其在低波长有微弱的紫外吸收导致基线不如甲酸体系平稳，最终选择甲酸甲酸铵为分离缓冲液。考虑到离子强度高导致分离时间延长、但过低会影响分析物的响应，所以选择50 mmol/L甲酸50 mmol/L甲酸铵。

　　pH是毛细管电泳分离的重要参数，三聚氰胺pKb=5，所以在pH 2.0～3.5范围内进行考察，得知随着pH增大，分析物的迁移时间延长。结合实际样品谱图中的干扰峰，在杂质峰不干扰药峰且分离时间最短的前提下，最后选择pH 2.5。

　　 3.2 仪器稳定性分析

　　在同样的分离条件下使用同一根毛细管柱，对同一样品连续测定3 d，每天进样6次，测定其迁移时间和峰面积的相对标准偏差(RSDs)。结果显示，迁移时间的日内与日间RSDs分别小于0.3%和0.5%; 峰面积日内与日间RSDs分别小于2.0%和6.0%，说明本方法的重现性和稳定性均较好。

　　3.3 提取液的选择

　　由于三聚氰胺在20%甲醇水溶液中溶解性较好，乙腈又具有较好的沉淀蛋白作用，所以比较了2%三氯乙酸、 20%甲醇2%三氯乙酸、 20%乙腈2%三氯乙酸3种提取液的提取效果。实验表明，含有甲醇和乙腈的三氯乙酸提取液混浊，过柱困难;而用2%三氯乙酸即可以达到很好的沉淀蛋白的作用，过柱顺利，且回收率高。实验选择2%三氯乙酸为提取液。

　　3.4 线性范围、检出限、回收率和相对标准偏差

　　在上述电泳条件下，三聚氰胺的峰面积与其浓度在1～100 mg/L范围内呈线性关系，其线性回归方程为y=6.4295x+11.853(y为峰面积，x为样品浓度)， r=0.9990。

　　分别对6个空白的生、熟鸡蛋样品进行测定，测得基线噪声平均值，以3倍信噪比(S/N=3)为检出限(LOD)，S/N=6为定量限(LOQ)，得到三聚氰胺的LOQ为0.25 mg/kg (见图1和图2)。

　　1，3. 杂质(impurities); 2. 三聚氰胺(melamine).对空白样品添加0.25、2.5和5.0 mg/kg三聚氰胺进行回收实验，每个添加水平平行5次，计算其回收率和日内相对标准偏差，连续测定3 d，计算日间相对标准偏差。结果见表1。表1 鸡蛋中三聚氰胺的添加回收率及相对标准偏差

　　HPCE法兼有电泳和色谱双重技术的特点。HPCE分离效率(理论塔板数为106～107/m)比HPLC法(理论塔板数为105/m)高，且分离快速，通常完成一次电泳操作&<20 min;经相同的前处理后，HPCE法比HPLC对三聚氰胺的分离效果更好，且分离时间约6 min (见图3a和b);HPCE样品消耗量(进样量在nL级)比HPLC(进样量在μL级)少;HPCE比HPLC经济环保，HPLC使用的色谱柱价格是毛细管柱(Agilent)价格的几倍。此外HPLC分析一个样品，时间越长消耗流动相越多(通常含有机相)，不仅价格昂贵，而且给环境造成严重的危害。而用HPCE检测一个样品只需1 mL缓冲溶液(全为水相)，价廉易得，对环境几乎无污染。当然由于HPCE进样量少、毛细管柱内径小、光程短(CE检测窗口仅为液相检测池的1/20)，此外CE采用紫外检测器，严重限制了它的灵敏度。王浩等[4]以HPLC测定宠物食品中三聚氰胺，经醋酸溶液提取后，部分提取液经混合阳离子交换小柱(MCX)净化，其方法的定量限为0.5 mg/kg。国标GB/T 223882008，乳制品中三聚氰胺检测方法，采用三氯乙酸溶液和乙腈提取，同样使用MCX净化，HPLC法的定量限为2 mg/kg。上述方法的前处理以及分析时间与本方法相近，但定量限比本方法高(0.25 mg/kg)，这主要与其稀释程度有关(文献[4]将样品稀释3倍)，而本实验采用浓缩的方法(浓缩4倍)使定量限较低，但本方法的重复性及抗干扰性仍能满足要求，这也体现了HPCE在分离效率上的优势。

　　3.6 抽样检测

　　从市场抽检12种不同品牌的鸡蛋样品，按本方法处理检测。结果显示，2份样品超过国家暂定残留标准，其三聚氰胺含量分别为11.78和6.83 mg/kg，经液相色谱质谱(HPLCMS)方法确认含量分别为12.68和4.42 mg/kg。结果表明本方法较为可靠。

　　3.7 三聚氰胺在鸡蛋中的分布

　　对6种不同阳性鸡蛋的蛋清和蛋黄分别处理，每个样品取2.0 g，分别测得蛋清和蛋黄中三聚氰胺的含量。结果显示，蛋清中的平均含量比蛋黄高20%。其原因可能与鸡蛋的形成过程有关。卵巢中的卵子经过9～10 d成熟后被排入输卵管，形成卵黄，经过输卵管伞部的尾端和膨大部分分泌蛋白形成浓蛋白，经过输卵管峡部时，吸收峡部产生的一些液体形成稀蛋白，质量增加一倍(蛋清与蛋黄的质量比约1.78∶1)，蛋清形成的过程约3 h，最后再形成蛋壳经阴道产出。母鸡食入含三聚氰胺的饲料，其中部分被吸收进入血液循环。蛋的形成过程中蛋清来源几乎全部来自母体腺体分泌，腺体分泌物的原料主要来自血液，且在短时间内形成蛋清;而蛋黄中的蛋白质合成是在肝脏中进行，合成的卵黄蛋白质经血液转运到卵巢，再转运到发育的卵中，在其成熟期间所需营养仅靠卵泡上的血管从卵巢获取。由此看来，蛋清的形成会从血液中获取更多的三聚氰胺，这可能是蛋清中三聚氰胺的含量比蛋黄中高的原因;此外，蛋清中的水高于蛋黄中的水，在鸡体内42 ℃的环境中，三聚氰胺更容易溶于水中。

参考文献

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