基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱分析蛋白质

　　　　 作者：倪国新 朱镭 马小土 徐学敏 胡晓芳 刘建华 李伟

【摘要】 为比较基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDITOFTOF)和电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱(ESIQTOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能，分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明，用MALDITOFTOF和ESIQTOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质，其中相同的蛋白质为633种;MALDITOFTOF和ESIQTOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质，其中3种为相同的蛋白质。实验数据说明，两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性，将两种仪器结合使用，不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率，而且可提高分析的置信度。

【关键词】 等量异位标签， 基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱， 电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱， 定性分析， 定量分析

　　1 引 言

　　基质辅助的激光解析电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)是目前用于多肽和蛋白质电离的两种主要方法。这两种方法在多肽离子化方面具有很大的互补性[1]。研究表明，MALDI 有利于碱性氨基酸残基的离子化[2]，ESI 有利于疏水氨基酸残基的离子化[3]。ESI源由于可与液相色谱分离的洗脱物在线连接，因此已成为蛋白质组学分析中广泛采用的离子化方式。但这种分析流程受到质谱分析的循环时间限制。近年来，LCMALDI技术的推广显著扩展了MALDITOFTOF在高通量蛋白质组学研究中的应用范围。由于多肽洗脱峰是离线收集的，因此不受质谱分析循环时间的限制。现阶段蛋白质组学定性和定量研究主要采用“鸟枪法”(Shotgun)进行，保证定性和定量的特异性的同时提高蛋白质鉴定的覆盖率，是一个迫切需要解决的问题。

　　定量蛋白质组学是功能蛋白质组学研究的重要组成部分。稳定性同位素标记结合在线或离线的液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)分析是目前定量蛋白质组学研究所采用的主要技术路线之一。常见的稳定性同位素标记方法包括SILAC(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)体内代谢标记[4]、ICAT(Isotopecoded affinity tags)[5]、iTRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantification)[6]、体外化学标记及18O稳定性同位素标记[7，8]。SILAC只适合细胞培养条件下进行氨基酸掺入标记，ICAT方法只能用于含有半胱氨酸的多肽标记和两组样品间的比较。iTRAQ可高效率标记赖氨酸残基和N末端的氨基，能同时进行4～8种样品的比较分析，而且适用于所有来源的蛋白质样品，因此在进行多个样品分析时具有明显优势。MALDITOFTOF和ESIQTOF是iTRAQ标记样品分析中常用的仪器，这两种仪器不仅采用不同的离子源，而且质量分析器构成也不同。前者的质量分析器是由两个飞行时间(Time of flight， TOF)分析器组成，后者的质量分析器则由一个四极杆和一个TOF质量分析器组成。已有研究者对上述两种仪器在大肠杆菌DNA结合蛋白质鉴定上的性能进行过比较[9]，但至今未见有关两种类型仪器在复杂蛋白质混合物定量分析上的性能比较报道。为了比较这两种仪器在iTRAQ标记样品分析中的性能，本实验设计利用iTRAQ标记的雌二醇刺激前后的MCF7细胞内蛋白质来评估MALDITOFTOF 和ESIQTOF的分析性能。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　HP1200毛细管液相色谱系统(美国Agilent公司); QStar XL MS/MS系统、Tempo NanoLC分离点靶系统和4800 MALDITOFTOF 蛋白质分析仪(美国Applied Biosystems公司)。

　　雌激素受体阳性(ER+)的人乳腺癌细胞株MCF7(上海市肿瘤所);RPMI1640培养基干粉、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Gibco公司);17β雌二醇(17βoestradiol， E2，美国Sigma公司);蛋白浓度测定试剂Dc Protein Assay(美国BioRad公司);iTRAQ Reagent MultiPlex Kit(美国Applied Biosystems公司);HPLC级超纯水和乙腈(美国Merk公司);其它试剂均为色谱纯。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 细胞培养与蛋白质抽提 MCF7细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在含5% CO2的37 ℃孵箱中培养，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。17β雌二醇用无水乙醇溶解后制成1.0 g/L的储存液，于-80 ℃冰箱中保存备用。

　　细胞实验分为溶剂对照组(加10 μL乙醇)和10 nmol/L E2处理组。将细胞传代于2个10 cm培养皿中，待细胞生长至约50%～60%聚合度时，分别加入上述试剂，继续培养24 h后，收集细胞。

　　清空各组培养皿中的培养基后，分别用4 ℃预冷的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，再将细胞刮下，转移至洁净的1.5 mL离心管中，离心后弃上清液。每管中加入200 μL 0.5 mol/L碳酸氢三乙酰胺裂解液，超声波破碎3次(每次10 s)，低温高速离心后，取上清液。测定各组蛋白的浓度后，-80 ℃保存备用。

　　分 析 化 学第37卷第9期倪国新等：基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱分析蛋白质 2.2.2 蛋白质酶解与iTRAQ化学标记 每组样品取蛋白质100 μg，分别置于洁净的微量离心管中，按iTRAQ标记试剂盒所提供的实验方案，进行半胱氨酸的封闭、胰蛋白酶酶解和含114，115报告基团的iTRAQ试剂标记，最后混合标记好的两组样品。

　　2.2.3 LCQTOF分析与数据处理 标记好的混合多肽进行真空干燥除去有机溶剂，用1 mL 上样缓冲液(10 mmol/L Kh3PO4，pH 3.0)稀释后加载到PolySulfoethyl A强阳离子交换柱(50 mm×0.32 mm， 5 μm， PolyLC， Columbia， MD)上，用1 mL上样缓冲液洗去裂解和标记过程中使用的TCEP，SDS，CaCl2和iTRAQ试剂后，用含有10， 20， 30， 40， 50， 60， 80， 100， 300和500 mmol/L KCl的上样缓冲液步进式洗脱柱上吸附的多肽，并分步收集洗脱下来的多肽(每个组分约500 μL)，最后用离心式真空干燥装置抽干。

　　干燥后的多肽样品用100 μL含有0.1% (V/V)甲酸的2%(V/V)乙腈溶解后，用反相纳升级液相色谱电喷雾串联质谱进行分析。采用HP1200毛细管液相色谱，每份样品上样 40 μL到富集柱(5 mm×0.3 mm， 5 μm， Michrom Bioresources， Auburn， CA)上，用缓冲液A(含0.1%甲酸的水溶液)以10 μL/min的流速脱盐10 min， 然后在线切换到反相C18分离柱(5 cm ×75 μm， 3.5 μm， Zorbax 300SB C18， Agilent公司)。洗脱梯度为： 2%～10%的缓冲液B(含0.1%甲酸的90%乙腈)2 min，然后在80 min内升高到50%缓冲液B以洗脱多肽，分流前后的流速分别为160 μL/min和250 nL/min。

　　从反相色谱柱洗脱出的多肽通过在线连接的QStar XL MS/MS系统进行串联质谱分析。分析在信息依赖性获取模式(Information dependent acquisition mode， IDA)下进行。在IDA模式下，先进行m/z 350～1700范围的全扫描，然后选择其中离子强度最高的4个离子峰进行二级子离子扫描。子离子谱图在m/z 100～2000范围内累加2 s，Q2设置为增强所有离子模式，动态排除采用±150 ppm的容许范围，排除时间设定为2 min。

　　将用AnalystQS 1.1 软件采集到的质谱分析数据导入基于Paragon算法[10]的ProteinPilot 2.0软件(Applied Biosystems公司)， 对IPI数据库(IPI_HUMAN335.fasta)进行检索鉴定蛋白，报告置信度在95%(Protscore ≥ 1.3)以上的蛋白质，同时用114，115报告离子的峰面积积分进行相对定量分析，以114为对照，按115与114的离子的峰面积积分比值选择P≤0.05的结果进行报告，上样误差通过软件自带的统计学偏畸值校正(Bias correction)功能进行归一化处理。对具有一个以上高置信度(≥ 99%)唯一多肽匹配的蛋白不再进行人工确认，对不含高置信度(≥ 99%)唯一多肽匹配的蛋白，用手工方法对MS/MS图谱碎片离子进行检查确认。

　　2.2.4 LCMALDITOFTOF分析与数据处理 上述标记样品用缓冲液(10 mmol/L Kh3PO4， pH 3.0)稀释10倍，上样到PolySulfoethyl A强阳性离子交换预装柱上，经上样缓冲液洗涤后，用含KCl浓度分别为35， 50， 75， 100， 125， 150， 175， 200， 250和300 mmol/L的缓冲液分步洗脱并分别收集各盐浓度洗脱的多肽。收集到的各组分样品，用含0.1% TFA的水稀释后上CapRod C18(15 cm×0.32 mm， 5 μm， Merck)反相柱进行梯度淋洗和点靶，流动相和基质(溶解在含0.1% TFA的50%乙腈中，浓度为5 g/L的α氰4羟基肉桂酸(CHCA))的流速均为2 μL/min，洗脱梯度为0～35%乙腈，洗脱时间为70 min，靶板上每个点的点样时间为7 s。

　　多肽的串联质谱鉴定和相对定量分析用美国Applied Biosystems公司生产的4800蛋白质分析仪进行。具体操作参数如下：一级质谱(MS)激光激发1250次，在阳离子模式下用反射模式进行检测。选择信噪比大于50的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析，每个样品点上最多选择15个母离子。二级MS/MS激光激发2500次，碰撞能量1 kV， CID碰撞小室内的氮气压力维持在2×10-4 Pa。蛋白鉴定和相对定量分析与前述QTOF数据处理相同。

　　2.2.5 多肽数据比对分析 多肽的脂肪族常数和疏水性用在线的Expasy分子生物学服务器的ProtParam工具完成(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)。氨基酸在用MALDI和 ESI鉴定到多肽中的出现率用SAS软件(SAS Institute Inc.，美国)完成。

　　3 结果与讨论

　　3.1 两种分析方法在蛋白质定性和定量分析上的比较

　　iTRAQ标记的多肽样品用QStar XL MS/MS和MALDITOFTOF进行了分析，通过比较获得的蛋白质定性和定量的实验数据发现，两者在定性和定量方面均存在显著差异。QStar XL MS/MS共鉴定到置信度&>95%的蛋白质1481个，其中E2刺激前后差异在0.5倍以上的蛋白质33个。MALDITOFTOF鉴定到置信度&>95%的蛋白质1719个，其中E2刺激前后差异在0.5倍以上的蛋白质38个。对两种仪器获得的数据进行对比发现，两种方法鉴定到的蛋白质中有633种是相同的; 找到上调或下调0.5倍以上的差异表达蛋白质中有3种是相同的。可见，MALDITOFTOF无论是在定性上还是在定量方面均较QStar XL MS/MS找到蛋白质多。文献[9]也得出过相似结论。这可能与MALDI采用了离线的液相色谱分离方式，而QStar XL MS/MS采用在线的LCMS/MS串联方式有关。MALDITOFTOF获得的子离子系列不仅离子强度较高，而且较为完整。

　　比较两种方法找到相同蛋白质的差异表达情况(表1)可见，蛋白质变化的方向是一致的，其中E2处理引起MCF7细胞中胰蛋白酶原C和1型胰蛋白酶的含量降低，引起细胞内EIF4A1的含量显著升高。其中用QStar XL获得的两种蛋白质下调的幅度和EIF4A1上调的幅度较MALDITOFTOF检测到的变化幅度大。对两种不同类型仪器获得的多肽串联图谱(图1)进行比较发现，用MALDITOFTOF分析获得的子离子强度较用QStar XL获得的子离子强度要高，得到的y离子序列较完整，这可能与MALDITOFTOF采用高能碰撞(High collision induced dissociation， HCD)以及检测灵敏度较高有关。QStar XL得到的b离子序列较MALDITOFTOF完整。根据文献[11，12]报道，这主要与碰撞诱导解离的方式有关。表1 用MALDITOFTOF 和QTOF找到的差异表达蛋白

　　3.2 两种分析方法在多肽鉴定分析上的比较

　　比较两种方法鉴定到置信度&>95%的多肽发现，ESIMS/MS鉴定到1660种多肽，MALDITOFTOF鉴定到1169种多肽。其中1096种为ESIMS/MS独有，605种为MALDITOFTOF独有，564种为两种方法共有。此结果与以往MALDITOFTOF 鉴定多肽的数目显著高于QTOF的报道相反[9]。从结果可表2 用ESI QTOF和MALDITOFTOF鉴定到多肽的分子量比较

　　Peptide molecular weight (Mw)LowHighAverageMALDI0.042899.453789.071657.9ESI0.001399.218508.492028.2以看出两种技术路线结合起来能够显著提高多肽鉴定的覆盖率。通过比较两者鉴定到多肽的质量误差(表2)可见，用ESIMS/MS得到多肽的质量误差(平均为0.001 Da)低于用MALDITOFTOF得到多肽的质量误差(平均为0.042 Da)。这与ESIMS/MS采用了全过程内参自动校正功能而MALDITOFTOF只在MS方式下进行分析前的一次校正有关。ESIMS/MS得到多肽的分子量上限高于MALDITOFTOF的分子量上限，这与ESI的多价电荷产生功能有关，在本实验中，ESIMS/MS的检测范围设定在m/z 300～1680，而MALDITOFTOF设定为m/z 9004000，上述实验结果与文献[9]一致。

　　比较多肽的性质(表3)可以发现，ESIMS/MS和MALDITOFTOF方法鉴定到多肽的C末端为R的多肽较K为多，两者的K/R比率分别为0.83和0.85， 这与文献[9]的结果不同。这可能是由于文献[9]中分析的是大肠杆菌中的DNA结合蛋白(DNA结合蛋白大多为偏碱性的蛋白质)，而且多肽和蛋白质的数目均显著低于本研究所致。ESIMS/MS较MALDITOFTOF更易于疏水性多肽的离子化，这与文献[9]的结果相同。本研究中ESIMS/MS鉴定到的多肽共由163330个氨基酸残基组成，MALDITOFTOF方法鉴定到的多肽由82210个氨基酸残基组成。对不同氨基酸残基在总氨基酸数目中所占的比例进行比较(图2)发现，ESI倾向于离子化含疏水性氨基酸(A，F，G，I，L，P，V)较多的多肽，这与文献[3]报道的结论一致;MALDI倾向于离子化含酸性氨基酸(D，E，N，Q)以及含羟基基团(S，Y)的多肽，这一现象还未见报道。 图2 不同氨基酸残基在用MALDITOFTOF和QTOF鉴定到的多肽中的比例

　　4 结 论

　　在线LCESIMS/MS和离线的LCMALDIMS/MS是目前蛋白质组学研究中进行高通量定性和定量分析时最常采用的两种方法。本研究比较了LCESIQTOF(QSTAR XL)和LCMALDI/TOFTOF在蛋白鉴定和iTRAQ定量分析方面的性能。研究发现，MALDI有利于含酸性氨基酸和有羟基基团的多肽的离子化，这有待用更多的实验数据进行证实。

　　在蛋白质鉴定方面，尽管LCESIQTOF可鉴定到多肽的数目要明显多于MALDI/TOFTOF，但通过数据库搜索鉴定到蛋白质的数目却显著低于MALDI/TOFTOF。两种方法在蛋白质鉴定和定量方面有很大的互补性，将两种方法结合使用，将能够显著提高蛋白质定性和定量的覆盖率，分析出的交叉部分则有较高的置信度。

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