1252紫外分光光度法快速测定小麦胚芽脂肪氧化酶活力

　　　　 作者：徐斌 董英 胡庆松 余雅斌 刘筠钧

【关键词】 紫外分光光度法 小麦胚芽 脂肪氧化酶活力

　　　1 引 言

　　小麦胚芽(WG)中的脂肪氧化酶(LOX)能催化氧化WG中的亚油酸，使WG短期内酸败变质。为延长保质期，常采用加热处理钝化LOX。为了最大限度地保护WG营养，加热温度和时间的选择尤为重要。而LOX 活性的准确测定则是进行麦胚稳定化理论研究的基础。研究表明，底物溶液的透明度、反应缓冲体系pH 、反应温度、底物及Tween浓度等因素均会影响测定结果。现有的测定方法的酶纯化过程繁琐。此外，不同来源的LOX的最适pH和最适温度有着较大差异，应根据原料类型进行选择。为此，建立了一种改良的WG中LOX的检测方法，简单快速获得了透明的底物溶液，省去了粗酶液纯化的繁杂步骤。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂 DU800 核酸蛋白分析仪(Beckman公司);BR4冷冻离心机(Jouan公司);pHS3B精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。小麦胚芽(江南面粉公司);亚油酸标准品(Fluka公司);其它试剂均为分析纯。

　　2.2 样品制备 取10 g小麦胚芽，粉碎，加入100 mL 0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.5)，4 ℃下搅拌30 min，悬浮液12000 r/min离心30 min，获得酶提取液。用醋酸盐缓冲液稀释10倍，作为酶测定液。

　　2.3 底物的配制 取111 μL亚油酸，无水乙醇定容到10 mL，取3.55 mL，加入40 μL Tween20。减压蒸去乙醇，残余物溶解在50 mL 0.05 mol/L Na2HPO4溶液中，1 mol/L NaOH调pH至9.0。底物中亚油酸浓度为2.53 mmol/L。

　　2.4 酶活的测定 检测波长234 nm，温度25 ℃;反应液：2.0 mL缓冲溶液，200 μL底物溶液，50 μL粗酶液;参比液：2.0 mL缓冲溶液，200 μL底物溶液，50 μL钝化处理的粗酶液。

【关键词】 紫外分光光度法 小麦胚芽 脂肪氧化酶活力

　　　1 引 言

　　小麦胚芽(WG)中的脂肪氧化酶(LOX)能催化氧化WG中的亚油酸，使WG短期内酸败变质。为延长保质期，常采用加热处理钝化LOX。为了最大限度地保护WG营养，加热温度和时间的选择尤为重要。而LOX 活性的准确测定则是进行麦胚稳定化理论研究的基础。研究表明，底物溶液的透明度、反应缓冲体系pH 、反应温度、底物及Tween浓度等因素均会影响测定结果。现有的测定方法的酶纯化过程繁琐。此外，不同来源的LOX的最适pH和最适温度有着较大差异，应根据原料类型进行选择。为此，建立了一种改良的WG中LOX的检测方法，简单快速获得了透明的底物溶液，省去了粗酶液纯化的繁杂步骤。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂 DU800 核酸蛋白分析仪(Beckman公司);BR4冷冻离心机(Jouan公司);pHS3B精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。小麦胚芽(江南面粉公司);亚油酸标准品(Fluka公司);其它试剂均为分析纯。

　　2.2 样品制备 取10 g小麦胚芽，粉碎，加入100 mL 0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.5)，4 ℃下搅拌30 min，悬浮液12000 r/min离心30 min，获得酶提取液。用醋酸盐缓冲液稀释10倍，作为酶测定液。

　　2.3 底物的配制 取111 μL亚油酸，无水乙醇定容到10 mL，取3.55 mL，加入40 μL Tween20。减压蒸去乙醇，残余物溶解在50 mL 0.05 mol/L Na2HPO4溶液中，1 mol/L NaOH调pH至9.0。底物中亚油酸浓度为2.53 mmol/L。

　　2.4 酶活的测定 检测波长234 nm，温度25 ℃;反应液：2.0 mL缓冲溶液，200 μL底物溶液，50 μL粗酶液;参比液：2.0 mL缓冲溶液，200 μL底物溶液，50 μL钝化处理的粗酶液。

　　3 结果与讨论

　　3.1 底物在不同pH条件下的稳定性 底物溶液分别用pH 4.5～9.0的缓冲溶液稀释10倍，随着时间的延长，由于亚油酸在酸性条件下溶解度下降，产生浑浊，由于光散射导致吸光度增大。pH值越低，吸光度变化速度越快;pH 4.5时达0.19%。而pH 8.0和9.0的底物溶液比较稳定，吸光度在2 h内基本保持不变。选择pH 7.0缓冲液稀释底物，每隔15 min测定粗酶液酶活一次。由于亚油酸溶解度的下降，参与催化反应的底物量减少，导致同样的酶液LOX酶活力2 h后测定值仅为初始值的69%。为此，本实验采用亚油酸Tween无水乙醇混合体系配制反应底物，使亚油酸完全溶解在Tween中，再通过滴加NaOH，能方便地获得透明的底物溶液。酶活测定时，在反应体系首先加入底物和所需pH值的缓冲液，稳定5 min，再加入待测酶液，能有效消除在中性和酸性缓冲体系下，亚油酸溶解度下降产生的误差。

　　3.2 底物浓度的优化 将不同浓度(0.31～15 mmol/L)的底物溶液，用pH 7.0缓冲溶液稀释10倍，进行全波长扫描。随着底物亚油酸浓度的增加， 234 nm处吸光度逐渐上升; 当底物浓度大于5.0 mmol/L时，溶液的吸光度为0.77，如再加入酶液，反应体系的吸光度很快上升到2.0，将产生较大误差。底物浓度小于2.5 mmol/L，溶液的初始吸光度则低于0.23。酶活测定时，反应体系吸光度3 min内上升到1.23，符合分光光度分析吸光度在0.1～1.0时线性关系最佳的要求。当底物浓度小于6.25×10-4 mol/L，由于亚油酸浓度过低，线性关系差。亚油酸的适合浓度范围为1.25～2.50 mmol/L。

　　3.3 Tween浓度的影响 配制3种含不同浓度Tween20的底物溶液(亚油酸浓度均为2.53 mmol/L)，测定酶活。结果表明，Tween20有效增加了亚油酸在缓冲溶液中的溶解度，特别是在pH&>8的碱性条件下。然而随着底物溶液中Tween20浓度增加到0.24%，Tween开始对LOX产生竞争抑制。Tween的合适浓度范围为0.08%～0.16%。

　　3.4 pH的影响 LOX在pH 4.5～8.5范围，均具有较高活力，最适pH为6.5。当pH&>9.0时酶活力开始减弱。综合3.1中pH对底物稳定性的影响，最适pH范围为6.5～7.5。在pH 7.0下，RSD=7.2%(n=8)。

　　3.5 温度的影响 在0～45 ℃，提高温度能显著增强LOX的活力; 随着温度进一步升高，活力开始下降，超过55 ℃时活力迅速下降，至65 ℃完全失活。综合考虑，反应温度选择25～35 ℃。在25 ℃下，RSD=5.3%(n=8)。

　　3.6 方法线性范围、回收率及精密度 粗酶液中蛋白值含量为122.5 mg/L。在粗酶液添加量5～70 μL范围内对LOX酶活进行分析，得到线性方程ΔA234/min=0.0053V-0.0075(ΔA234/min为每分钟吸光度的变化;V为加酶量，μL)，r=0.9984。添加20 μL粗酶液，添加回收率为88.3%，RSD=6.9%(n=8)。