固相萃取高效液相色谱电喷雾串联质谱法分析芍药和酒芍药的水溶性化学成分

　　　　 作者：何忠梅 孙佳明 张辉 王华

【摘要】 利用固相萃取高效液相色谱电喷雾串联质谱法(SPEHPLCDADESIMS2)分析了芍药(Paeonia lactiflora Pall.)及其炮制品酒芍药(Paeonia lactiflora Pall.preparated with wine)水煎液中化学成分的种类和结构，并对其主要有效成分芍药苷进行了定量测定。用此方法得到了芍药和酒芍药水煎液的紫外色谱(UV)图、总离子流色谱(TIC)图和萃取离子色谱(EIC)图，以及相应色谱峰的紫外光谱图和EIC/MS2的质谱图。对其进行解析，发现芍药和酒芍药水煎液中所含化学成分基本一致，但酒芍药水煎液中除主要活性成分芍药苷含量基本未变外，其它酚酸性化学成分含量相对于芍药水煎液均有不同程度的下降。同时鉴别出芍药和酒芍药水煎液中共同含有的16种成分，它们分别是：蔗糖、(+)儿茶素、Mudanpioside E、芍药新苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、芍药苷、羟基芍药苷、没食子酰芍药苷*、牡丹皮苷Ⅰ、苯甲酰芍药苷、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖。以上分析说明，酒炙可保留芍药的药效，同时“缓和其酸寒伐肝之性”。

【关键词】 芍药， 固相萃取， 高效液相色谱， 电喷雾串联质谱， 水溶性

　1 引 言

　　中药芍药是毛茛科芍药亚科芍药属多年生草本植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根。具有免疫调节、镇痛、镇静、解痉、保肝、扩张血管、抗炎等作用。芍药的主要有效成分为单萜及单萜甙类化合物，根据基本骨架可分为具有笼状蒎烷结构的单萜及单萜甙类化合物和具有内酯结构的单萜及单萜甙类化合物。芍药根中还含有部分三萜化合物以及鞣质等[1]。

　　芍药生品味苦、酸，性微寒。芍药酒炙后酸寒伐肝之性降低[2]。近年来，对芍药中化学成分的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、薄层扫描法(TLCS)和高效液相色谱电喷雾串联质谱法(HPLCMS)[3～5]。而对于经过炮制后的酒芍药的化学成分的研究主要集中在使用高效液相色谱结合标准品对芍药主要单萜苷类化合物芍药苷的定量研究上。而高效液相色谱(HPLC)与二极管阵列紫外检测器(DAD)及电喷雾电离质谱联用技术(HPLCDADESIMS2)现已成为植物粗提物中成分分离和定性分析的强有力工具[6]。固相萃取(SPE)技术用于水溶性样品纯化和浓缩[7]。本实验利用固相萃取高效液相色谱电喷雾串联质谱法(SPEHPLCDADESIMS2)技术对芍药和酒芍药水煎液中化学成分进行分析，为芍药的传统炮制机理的科学内涵提供了进一步的实验依据。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　1100型LCMSD液质联用仪(美国安捷伦公司)，包括Agilent SL 型多级离子阱质谱仪、低压四元梯度泵、二极管阵列检测器 (DAD)、自动进样、柱温箱、Chemistation 化学工作站等;GL20GH型低温超速离心机;BP211D型十万分之一电子天平 (北京赛多利斯天平有限公司);固相萃取(SPE)小柱(北京艾杰尔科技有限公司)。

　　芍药(长春北京同仁堂药店)经鉴定为毛茛科芍药亚科芍药属多年生草本植物芍药的干燥根。乙腈、甲醇和甲酸为色谱纯(Fisher公司);水为超纯水(MilliQ公司)。

　　2.2 样品制备

　　2.2.1 酒芍药的制备 取芍药片10 g，加入黄酒1.0 g，稍闷润，待酒被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出晾凉，备用。

　　2.2.2 芍药和酒芍药水煎液的制备 将芍药和酒芍药各10 g粉碎，粗粉分别加20倍量水浸泡30 min，微沸提取2次，提取时间分别为40和20 min，过滤，合并滤液，浓缩，定容到100 mL。

　　2.2.3 芍药和酒芍药水煎液SPE前处理 以1 mL甲醇活化固相萃取小柱，用1 mL水平衡。将上述水煎液样品1 mL上柱，用1 mL水洗脱杂质，再加1 mL甲醇洗脱，收集洗脱液。甲醇洗脱液过0.22 μm膜，供高效液相电喷雾质谱联用仪分析。

　 2.3 色谱和质谱条件

　　Agilent ZORBAX SBC18 色谱柱(150 mm×4.6 mm， 5 μm);流动相： 甲醇/乙腈(含0.1%甲酸)/0.1%甲酸水溶液三元线性梯度洗脱，流动相梯度设置见表1。流速： 0.6 mL/min;检测波长： 230 nm;柱温： 30 ℃;进样量： 10 μL。表1 高效液相色谱流动相梯度表

　　3 结果与讨论

　　3.1 芍药和酒芍药水煎液中化学成分的色谱研究

　　实验结果表明，经甲醇/乙腈(含0.1% 甲酸)/0.1%甲酸水溶液三元线性梯度洗脱，芍药和酒芍药水煎液中化学成分得到了较理想的分离效果，二者HPLCDADUV2图及其对应的HPLCESI TIC总离子流色谱图见图1。

　　图1 芍药(A)和酒芍药(B)水煎液中化学成分的高效液相色谱图和总离子流图

　　Fig.1 HPLC chromatogram and TIC chromatogram of compounds in aqueous of Paeonia lactiflora Pall.and Paeonia lactiflora Pall.preparated with wine 同时这些色谱峰对应化合物的紫外光谱图都呈现本属特有单萜苷类化合物的紫外吸收特征。本属大多数的单萜萜苷类化合物联有苯甲酰基或没食子酰基取代，故其紫外光谱图上的最大吸收波长随着单萜苷元或糖上的取代基的种类不同而有所变化。一般只联有苯甲酰基的单萜苷的紫外最大吸收波长为230 nm，而联有没食子酰基取代的单萜苷或糖的吸收红移至280 nm。

　　3.2 HPLCDADESIMS2方法测定芍药和酒芍药水煎液中的化学成分

　　电喷雾质谱是一种软电离技术，在正离子模式下，经常同时出现[M+H]+， [M+Na]+， [2M+H]+， [2M+Na]+等一系列准分子离子峰。根据芍药和酒芍药的水煎液中化学成分准离子峰可确定各化合物的分子量信息，通过碰撞诱导解离(CID)使目标化合物碎裂成碎片离子，从而可进一步获得各化合物的结构信息。例如芍药和酒芍药中共有的苯甲酰基芍药苷的准分子离子峰[M+Na]+(m/z 607)，说明其分子量为584;在碰撞诱导解离过程中，m/z 607离子失去一分子苯甲酸(122 Da)生成m/z 485离子;m/z 607离子失去两分子苯甲酸(244 Da)生成 m/z 363离子;m/z 607离子失去一分子苯甲酰基葡萄糖(266 Da)生成m/z 341离子;m/z 607离子失去一分子苯甲酸(122 Da)和一分子苯甲酰基葡萄糖(266 Da)生成m/z 219离子

　　采用HPLCDADESIMS2联用技术，根据每一组分的色谱保留时间、紫外吸收特征、准分子离子峰和二级质谱碎片信息，并

参考文献

[8～13]进行解析，鉴定了芍药和酒芍药水煎液中含有的16个化学成分的可能结构。同时发现芍药和酒芍药水煎液中的每个对应色谱峰的保留时间、紫外吸收特征、准分子离子峰和二级质谱碎片信息均基本相同，这说明二者水煎液中的主要化学成分的种类和数量基本一致。芍药和酒芍药水煎液中16个化学成分的HPLCDADESIMS2分析结果见表2和表3。表2 芍药和酒芍药水煎液中化学成分正离子扫描模式的HPLCDADESIMS2分析结果

　　 3.3 芍药和酒芍药水煎液中主要化学成分含量测定

　　由于芍药和酒芍药水煎液中的每个对应色谱峰的保留时间、紫外吸收特征、准分子离子峰和二级质谱碎片信息均基本相同，因此每个色谱峰的峰面积的变化可以大致反映对应化合物的含量的变化。芍药和酒芍药水煎液中15个化学成分的对应色谱峰的峰面积的变化见表4。对酒芍药水煎液中各色谱峰的峰面积与芍药水煎液中对应的色谱峰的峰面积进行对比分析，发现除了芍药苷的峰面积基本未变外(3.9%)，其余色谱峰的峰面积均有不同程度的减少，这说明酒芍药水煎液中主要活性成分芍药苷的含量并未产生大的变化，但其它酚酸性化学成分含量相对于芍药水煎液均有不同程度的下降。尤其是(+)儿茶素的含量下降尤为明显，仅为酒炙前的37.2%，其它酚酸性成分下降至酒炙前的40.7%～87.4%不等。这可能是由于酒炙过程中经过高温炒制所致。而且这也在一定程度上说明“芍药酒炙后酸寒伐肝之性降低”的原因是由于芍药含有的酸性成分，如联有没食子酰基的单萜苷类和儿茶素类化合物经过酒炙后含量下降所致。表4 芍药和酒芍药水煎液中化学成分的峰面积

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