反相高效液相色谱法检测鲫鱼肌肉中伊维菌素

【摘要】 以鲫鱼肌肉为材料，建立了一种简便、准确的反相高效液相色谱法，用于鱼肉中伊维菌素的药物残留检测和药代动力学研究。鲫鱼肌肉中的伊维菌素用乙酸乙酯提取，离心后的上清液于45 ℃下氮气吹干，残渣用甲醇水(4∶1，V/V)混合液溶解，正己烷去脂，离心后取下清液，进样20 μL进行HPLC分析。本方法考察了提取剂、柱温和流动相的影响，确定了以乙酸乙酯为提取剂，柱温25 ℃和甲醇水(90∶10，V/V)为流动相的优化条件。方法线性范围为0.025～2.50 μg/g，相关系数r=0.9997，检出限为11 ng/g。批内RSD为1.0%～5.8%，日间RSD为1.0%～7.7%，相对回收率(99.8±4.1)%， 绝对回收率为(95.9±3.9)%。本方法具有操作简便，结果准确可靠的特点。

【关键词】 伊维菌素，鲫鱼，肌肉组织，残留检测，反相高效液相色谱

　1 引 言

　　伊维菌素(ivermectin，IVM)为阿维菌素的衍生物，是目前最优秀的广谱抗寄生虫药之一，具有广谱、高效、用量小、安全等优点，对生物体内外寄生虫，特别是线虫和节肢动物均有高效驱杀作用。1981年投入市场后，在临床兽医中得到了广泛应用。而其在水产养殖寄生虫病害防治方面的应用也引起了人们的关注。目前，动物体内伊维菌素残留的检测方法主要有HPLCUV检测法[1]和HPLC荧光检测法[2，3]。但这些方法多为家畜样品的药物残留检测，对鱼体内IVM的测定方法研究甚少。Pantelis等[4]利用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)测定了IVM在海鲷内的含量; Zhang等[5]利用液相色谱串联质谱法测定了鳗鱼体内IVM的残留量; 赵思俊等[6]采用HPLC法检测动物肌肉中多种药物残留;沈金灿等[7]采用HPLCMS法检测动物肌肉中兽药残留。这些方法各具优缺点，样品前处理过程均较复杂，且耗时。本研究以鲫鱼为实验对象，对肌肉样品的前处理过程进行了优化，采用反相高效液相色谱法分析了鲫鱼肌肉中IVM的残留量。研究结果可为鱼体肌肉组织中IVM的残留检测及药代动力学研究提供参考。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　SHIMADZU高效液相色谱仪(HPLC)，配有SPD20A紫外检测器;SupRa22K冷冻离心机;QGC24T氮气吹干仪;FSH2匀浆机;SK2200L超声波仪;H101漩涡混合器。伊维菌素标准品(Sigma公司);甲醇(色谱纯，Merck公司);乙酸乙酯(色谱纯，Urchem公司);正己烷与无水Na2SO4均为分析纯(国药公司);水为MilliQ超纯水。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 色谱条件 VPODS C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相为甲醇水(90∶10， V/V)，流速1.0 mL/min。柱温为25 ℃; 紫外检测波长为245 nm; 进样量20 μL。

　　2.2.2 标准溶液的配制 准确称取50 mg伊维菌素标准品于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得1 g/L的标准储备液。精确量取1 mL标准储备液于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得10 mg/L的标准A溶液。精确量取标准A溶液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为0.025， 0.05， 0.10， 0.25， 0.50， 1.00和2.50 mg/L的系列标准工作液 。

　　2.2.3 样品的处理 称取鲫鱼肌肉组织(1.0000±0.0010) g于10 mL烧杯中，剪碎后加少许无水Na2SO4和3 mL乙酸乙酯，以10000 r/min匀浆30 s，将匀浆液倒入10 mL尖底玻璃离心管A中，以3 mL乙酸乙酯洗涤刀头和小烧杯，将洗涤液全部倒入A管，超声提取10 min，以5000 r/min离心8 min，将上清液倒入另一支10 mL尖底玻璃离心管B中，A管残余物再用5 mL 乙酸乙酯提取一次，涡旋振荡30 s，超声，离心后，合并上清液于B管中，在45 ℃用氮气将B管提取液吹干后，向B管中加入1 mL甲醇水(4∶1，V/V)混合液，超声5 min 使残渣完全溶解，再加入1 mL正己烷，涡旋振荡30 s，3000 r/min离心3 min，取下清液1 mL，以0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液进行RPHPLC检测。

　　3 结果与讨论

　　3.1 样品处理方法的选择和色谱分析条件的优化

　　3.1.1 提取剂的选择 自生物样品中提取IVM的常用提取剂有乙腈、乙酸乙酯和甲醇。通过标准加入实验，测得3种提取剂的平均绝对回收率分别为90.5%， 95.9%和83.1%。甲醇提取的回收率最低，且提取物杂质多，对IVM峰的干扰很大。乙酸乙酯和乙腈提取IVM时，基质背景相对干净，IVM峰两边基线平稳，分离效果很好。由于乙酸乙酯提取的回收率最高，且比乙腈更易以氮气吹干，因此选用乙酸乙酯为提取剂。

　　 3.1.2 去脂过程的处理 本实验用正己烷去脂，但正己烷与甲醇部分互溶，因此，前处理过程中，氮气吹干后的残渣不能直接加甲醇溶解定容。实验发现，甲醇水(4∶1，V/V)混合液能很好地溶解残渣，且与正己烷不互溶。因此，氮气吹干后的残渣用甲醇水(4∶1，V/V)混合液溶解定容。

　　3.1.3 流动相的选择 当流动相中甲醇与水的比例分别为100∶0， 93∶7， 91∶9和90∶10时，IVM的出峰时间分别为3.5， 8.1， 9.5和13.1 min。实验表明，当用甲醇水(90∶10，V/V)为流动相时，IVM与杂质分离良好，基线平稳，左右无干扰峰。提高流动相中甲醇的比例会使IVM出峰时间提前，IVM还未与杂质完全分离就出峰，将导致IVM峰两边的基线不平，因此本实验选用甲醇水(90∶10，V/V)为流动相。

　　3.1.4 柱温的选择 比较了20， 25和35 ℃时IVM的色谱图可见，温度越高，IVM的保留时间越短。当用甲醇水(90∶10，V/V)为流动相时，3个温度条件下IVM的保留时间分别为14.7， 13.1和10.9 min。IVM的峰形变化不大，柱效值分别为3542， 3797和4084。高柱温时峰形略尖，但由于保留时间会较短，受样品中背景基质的影响，有时会出现IVM峰两边基线不平的现象。综合考虑保留时间、柱效和分离度，本实验选用柱温为25 ℃。 图1 IVM的色谱图

　　3.2 色谱行为

　　图1为IVM标准工作液、加标肌肉样品及空白肌肉样品的色谱图。由图1可知，在本实验条件下，基线走动平稳，IVM的保留时间约为13 min，无干扰峰出现。

　　3.3 标准曲线

　　取质量浓度分别为0.025，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00和2.50 mg/L 的IVM系列标准溶液20 μL，直接进样，进行HPLC分析，每个浓度平行测定2次，在质量浓度为0.025～2.50 mg/L的范围内，IVM色谱峰面积与其浓度具良好的线性关系，A1= 39683C1-680.34，相关系数r=0.9999。

　　准确称取空白鲫鱼肌肉样品(1.0000±0.0010)g于10 mL烧杯中，剪碎并向小烧杯中分别添加1 mL质量浓度为0.025， 0.05， 0.10， 0.25， 0.50， 1.00和2.50 mg/L的系列标准工作液，避光静置1.5 h，按2.2.3项方法，每个浓度平行测定2次，在标准加入质量浓度为0.025～2.50 μg/g时，肌肉样品中IVM色谱峰面积与其浓度具良好的线性关系，A2= 35538C2+ 274.39，相关系数r=0.9997。

　　3.4 精密度和回收率

　　分别取含IVM 0.125， 0.50， 2.50 μg/g的3种不同质量浓度加标肌肉样品，按2.2.3项方法，每隔一天测1次，共测3次，每个浓度平行测定5次，据此计算批内和日间精密度(RSD)，结果见表1。肌肉样品批内RSD为1.0%～5.8%; 日间RSD为1.0%～7.7%。肌肉样品的相对回收率为96.9%～101.9%; 绝对回收率为91.8%～103.8%。表1 鲫鱼肌肉组织中IVM的回收率和精密度

　　 3.5 方法检出限

　　根据美国 EPA SW846的规定进行方法检出限(method detection limits，MDL)的研究[8]，测定2组低浓度加标样品(0.05 μg/g)，每组设7个平行样，进行差异显著性分析，计算标准偏差S。以公式MDL=3.143 S求出方法检出限。

　　取α=0.05，经差异显著性检验可知F=0.64﹤F(0.05)=4.75，两组数据无显著差异。计算可得S=0.003452，MDL =0.011，即本方法的检出限为11ng/g。表2 RPHPLC 方法检出限的测定结果

　　IVM在水产养殖中的应用已很广泛，但由于其存在较大的水生态风险，欧洲许多国家并未批准其作为渔药使用，而目前我国尚无这方面的规定。农业部颁布的NY 50292001和NY50442001二则无公害食品质量标准规定：猪肉脂肪中IVM的含量不得超过0.02 mg/kg，牛肉脂肪中IVM的含量不得超过0.04 mg/kg[9，10]。尽管IVM在鱼肉中的最高残留量尚无规定，鉴于目前IVM在水产养殖中的广泛应用及食品安全的重要性，研究出一种适合检测鱼肉内IVM含量的方法已十分必需。本实验以鲫鱼为实验对象，对肌肉样品的前处理过程进行了优化，省去SPE柱净化环节，然后采用RPHPLC紫外检测法对其进行检测。实验方法简便，回收率高，且获得了良好的IVM色谱图。本方法的检出限为11 ng/g，低于商检行业标准的方法检出限(0.015 mg/kg)[11]。本方法操作简便、快速、准确，适用于IVM在鱼体内的药代动力学研究及鱼体内IVM的残留检测分析。

参考文献

　　1 Zhao JianHong(赵剑虹)， Sun ChengJun(孙成均)， Mao LiSha(毛丽莎)， Yin ZongNing(尹宗宁)， Jiang Bo(江 波)， Li YongXin(李永新). Journal of Sichuan University(Medical Science Edition)(四川大学学报 医学版)，2005，36(1): 130～131

　　2 Liu YingGui (刘迎贵)， Su Ya(苏 亚)， Han Qi(韩 琪)， Bao QingShan (包青山). Chinese Journal of Veterinary Drug(中国兽药杂志)，2007， 41(7): 28～31

　　3 Markus J， Sherma J. Journal of AOAC International， 1992， 75(4): 757～767

　　4 Pantelis K， Michalis P， Joan I G. Environmental Toxicology and Pharmacology， 2004，17: 9～12

　　5 Zhang Yun(张 云)， Jiang ChangMu (江昌木)， Chen Hong(陈 虹)， Tang QingQiang (唐庆强)， Lü YuanYuan(吕园园). Analytical Laboratory(分析试验室)，2008， 27(5): 104～107

　　6 Zhao SiJun(赵思俊)， Li Cun(李 存)， Jiang HaiYang(江海洋)， Li BingYu(李炳玉)， Shen JianZhong(沈建忠). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2007， 35(6): 786～7907 Shen JinChan(沈金灿)， Pang GuoFang(庞国芳)， Xie LiQi(谢丽琪)， Lin YanKui(林燕奎)， Chen PeiJin(陈沛金)， Han RuiYang(韩瑞阳). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2007， 35(11): 1565～1569

　　8 EPA SW846， The Method Detection Limit Procedure of the U.S. Environmental Protection Agency. http://www.cee.vt.edu/ewr/environmental/teach/smprimer/mdl/mdl.htmL#USEPA

　　9 NY5029—2001. Pollution Free Food Pork(无公害食品 猪肉 )Standards of Agriculture(农业标准)

　　10 NY5044—2001. Pollution Free Food Beef(无公害食品 牛肉) Standards of Agriculture(农业标准)

　　11 SN 06501997. Method for the determination of ivermectin residues in meats and meat products for export(出口肉及肉制品中伊维菌素残留量的检测方法 液相色谱法) Standards of commodities for export(商检行业标准)