基于聚酰亚胺基底的细胞电融合芯片的研制

　　　　 作者：胡宁　杨军　郑小林 阴正勤 徐海伟

　　　　 张兴国　曹毅 杨静 夏斌 许蓉 鄢佳文 蒋凤

【摘要】 基于柔性印刷电路板(flexible printed circuits board， FPCB)技术，通过在聚酰亚胺基底薄膜表面层压的铜箔上刻蚀微电极阵列结构制备了一种细胞电融合芯片。在低电压(≤40 V)条件下实现了细胞电融合，融合效率达37%，远高于聚乙二醇(polyethylene glycol， PEG)法及传统细胞电融合方法。与传统细胞电融合系统相比，此芯片可在低电压条件下工作，具有结构简单、成本低廉、实验过程可观察、融合通量高等优点。另外，聚酰亚胺薄膜基底良好的柔软度可保证此芯片与其它分析模块(如细胞筛选分离模块)的有效集成，具备构造微全分析系统(micro total analytical system， μTAS)的巨大潜力。

【关键词】 聚酰亚胺薄膜，电融合，芯片，微电极，柔性印刷电路板

　1 引 言

　　随着微机电系统(micro electromechanical system，MEMS)技术的快速发展和生命科学研究的现实要求，细胞电融合与生物芯片技术的结合逐渐深入，关于细胞电融合芯片的研究也越来越多[1～5]。目前，细胞电融合芯片融合通量普遍较低[6]，难以满足高效融合的要求。此外，细胞电融合微全分析系统(micro total analytical system， μTAS)的概念也对芯片的集成和整体封装提出了更高要求[7]。

　　现有融合芯片主要用硅材料加工，但是由于硅片面积、工艺及成本的限制，不利于加工大规模的微电极阵列，从而限制了硅芯片技术的融合通量。此外，硅芯片的高硬度和不透明性也为芯片封装及实验观察带来了不利影响。本研究结合柔性印刷电路板(flexible printed circuits board， FPCB)技术，在面积较大的聚酰亚胺基底上加工了大量微电极组成的电极阵列，从而实现了一种柔性细胞电融合芯片，具备高通量融合的巨大潜力。

　　2 实验部分

　　2.1 材料

　　PBS磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司);胰酶，DMEM高糖(海克隆生物化学制品有限公司);标准胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限公司);1.0%纤维素酶R10酶溶液、0.5%离析酶R10(日本Yakult公司);10%甘露醇(北京鼎国生物技术公司)。CPW盐溶液： 27.2 mg Kh3PO4， 101.0 mg KNO3， 1480.0 mg CaCl2·2h3O， 246.0 mg MgSO4·7h3O， 0.16 mg KI， 0.025 mg CuSO4·5h3O溶于1 L 三次蒸馏水中，调pH值至5.8;PM缓冲液：0.3 mmol/L MgCl2，0.3 mmol/L CaCl2， 1.2 mol/L山梨醇。其它试剂均为为分析纯。

　　HEK293细胞的制备：取生长良好的HEK293细胞，弃上清液。以3 mL PBS冲洗，弃上清液，反复进行3次。加入PBS和胰酶各2～3滴，消化1 min。加入3～5 mL培养液，其中V(DMEM高糖)∶V(标准胎牛血清)=10∶1，将贴壁细胞洗落、吹散，移至10 mL离心管中，离心(2000 r/min， 5 min)，弃上清液。加3 mL培养液将细胞吹散，分装。

　　烟草叶肉原生质体的制备：将烟草K326无菌苗幼嫩叶片切成细丝，取1.0 g置于13%甘露醇液体中，质壁分离(约3 h)后置于10 mL酶液中进行酶解。酶解过程在26.5 ℃黑暗条件下恒温振荡(50 r/min)12～16 h。酶解结束后，经不锈钢筛网过滤，滤液经500 r/min离心7 min。去除上清液，向所得沉淀中缓慢加入6 mL CPW21溶液(CPW盐溶入21%蔗糖)，

　　A. 芯片纵向结构(section structure of chip); B. 芯片水平结构(plane structure of chip).并使沉淀悬浮，以400 r/min离心6 min，用巴斯德吸管小心地将处于离心管上部的原生质体带吸出，并以CPW10溶液(CPW盐溶入10%甘露醇)洗涤3次。

　　2.2 芯片制作

　　2.2.1 芯片加工 芯片加工过程：清洗聚酰亚胺薄膜，钻孔，沉积铜箔，层压，曝光，显影，蚀刻形成微电极阵列结构。镀金，在焊盘位置喷锡，外围裁减，等离子清洗，防氧化处理(芯片纵向结构见图1)。通过上述处理，获得了基于聚酰亚胺基底的细胞电融合芯片，面积为6 cm×5 cm，微电极阵列区面积为4 cm×3 cm，共有2.2×104个微电极。

　　2.2.2 芯片封装 制作一个不锈钢模具，超声清洗，烘干后用等离子清洗，随即放入培养皿中，倒入混合好的V(PDMS单体)∶V(固化剂)=10∶1混合物，真空去除气泡，70 ℃恒温90 min，随后沿模具边缘切割将固化的PDMS揭下， 图2 聚酰亚胺细胞电融合芯片

　　Fig.2 Cellelectrofusion chip based on polyimide membrane得到所需的PDMS盖片。在盖片上开出直径2 mm的孔，置入柔性导管，用粘合剂固定。最后，在芯片上焊接导线，然后固定于培养皿上。将PDMS盖片等离子清洗5～10 min后盖于柔性微电极阵列芯片上，得到封闭的细胞电融合芯片(图2)。

　 2.3 实验过程

　　细胞以PM缓冲液调节至1 × 105个/mL，形成细胞悬浮液。向芯片中加入1.5 mL细胞悬浮液，待其充满芯片后施加正弦排队信号(峰值电压Epp=6 V，频率f=1 MHz)，完成细胞排队;随后施加电脉冲穿孔信号(脉宽=50 μs，脉冲间隙=900 ms，Epp=35 V，脉冲个数3～5个)，最后，施加正弦促融信号(电压峰峰值Epp=6 V，频率f=1 MHz，衰减率为-50%/min)，完成融合。实验中细胞融合过程由图像采集系统记录。 图3 细胞在芯片内部排队效果

　3 结果和讨论

　　在正弦交流信号产生的介电电泳力作用下，细胞会按电场梯度方向排队(图3)。实验中，2～10 V的正弦交流电信号可使细胞间相互紧密排列形成串珠。串珠中细胞的数目与电信号大小成正比。通过调节信号的大小，可使绝大部分细胞呈两两排队，如烟草原生质体超过70%(图3A)，HEK293细胞(转染腺病毒后发绿色荧光)超过60%(图3B)。细胞在20～100 V的电脉冲信号作用下发生电穿孔，并在衰减的正弦促融信号作用下完成电融合(图4)。芯片实验所用电信号远远小于传统电融合装置。计数分析表明，HEK293细胞的融合率达到37%，远高于PEG方法(≤1‰)和普通电融合方法(≤5%)。

　　传统细胞电融合系统多采用大型融合槽，可一次操作超过1 mL的细胞悬浮液。但它难以控制细胞的排队过程，多细胞排队和融合比例很高，使融合细胞失去分化能力，降低了实际融合效率。本芯片采用合适的电极间距和排队信号来加强对细胞排队效应的控制，提高两两排队的比例。

　　利用ANAYS10.0仿真软件，模拟了10 V电压下微电极阵列附近的二维电场分布(图5)。结合细胞电融合理论[8～11]，分析了相对微电极中点(图5 AB中点)连线的电场梯度的变化情况(图6)。 图4 Hek293细胞在芯片内融合效果

　　Fig.4 Onchip fusion process of HEK293 cells

　　A. 排队信号60 s后的细胞排队(cell alignment (60 s after cell alignment signal)); B. 脉冲信号5 s后的细胞电穿孔(cell electroporation (5 s after pulse signal)); C. 脉冲信号40 s后的胞质融合(fusion of cytoplasm (40 s after pulse signal)); D. 脉冲信号130 s后融合完成(fused cell (130 s after pulse signal))。 图5 芯片内部电场分布情况

　　Fig.5 Electric field distributing profile in chip 图6 沿采样路径电场梯度分布曲线

　　Fig.6 Electric field intensity gradient along sampling path结果显示，从A点开始，电场梯度快速升至极大值(距离微电极约5 μm)后逐渐下降。在距离20～70 μm之间一直处于较低水平(&<0.0002 V2/μm)，然后又逐渐回升。这表明，在微电极附近，细胞受到较大的介电电泳力而容易排队，在微通道中央受到的介电电泳力较小而难以排队。而且，从图5可见，在微电极附近区域(距离&<10 μm范围)电场强度较大，因此排队细胞受到较高的击穿电场作用而实现更高的融合率。

　　柔性芯片上的实验与仿真结果一致，靠近电极的细胞能实现排队，而在中间区域的细胞排队较少，而且，较大的电极间距容易造成多细胞排队; 在芯片设计和实验过程中，通过调整电场梯度的大小，使绝大多数细胞能实现两两排队。本芯片在排队电压2～10 V时，可使多数直径5～10 μm的细胞实现两两排队(见图3)，为获得较多的两两细胞融合奠定了基础。4 结 论

　　与传统细胞电融合系统和已有细胞电融合芯片技术相比，柔性微电极阵列细胞电融合芯片具有很多优点。首先，电极间距减小降低了融合电信号及外围电路制作成本，且聚酰亚胺芯片的加工成本也明显低于硅芯片技术;其次，融合通量高。可以在聚酰亚胺基底上集成大量微电极(集成度可以高达10000个电极/cm2，本次实验所用的4 cm×3 cm的芯片上共集成了2.2×104对微电极)来实现高通量融合，在单次实验中获得足够数量的融合细胞进行后期培养，降低了细胞受污染的风险，提高了研究效率;第三，聚酰亚胺薄膜极佳的透光性提供了很好的观察效果。最后本芯片良好的柔韧性有利于它与其它芯片模块实现集成，降低了封装难度，也较好地解决了灭菌问题，为多功能细胞芯片实验室(cell lab on a chip)的实现奠定了基础。

　　本实验发现，电极间距较大不利于两两细胞排队，进而会影响融合效率。这一结果为芯片设计中如何提高细胞排队率，改善融合效率奠定了理论基础。在此基础上设计的融合芯片上，细胞排队效果良好，两两排队率高，实际融合效率达到37%，远高于传统PEG方法(≤1‰)和普通电融合方法(≤5%)。

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　　Polyimide Membrane Based Flexible Cellelectrofusion Chip

　　HU Ning1， YANG Jun*1， ZHENG XiaoLin1， YIN ZhengQin2， XU HaiWei2， ZHANG XingGuo3，

　　CAO Yi1， YANG Jing1， XIA Bin1， XU Rong1， YAN JiaWen1， JIANG Feng1

　　1(State Key Laboratory of Power Transmission Equipment && System Security and New Technology，

　　Bioengineering College， Chongqing University， Chongqing 400030)

　　2(Department of Ophthalmology and Visual Sciences， Affiliated SouthWest Hospital，