Ce吐温40色氨酸化学发光体系的研究与应用

【摘要】 实验观察到在酸性条件下，色氨酸能够增强Ce和吐温40的化学发光反应，其发光强度的增加与色氨酸含量在一定的范围内呈线性关系，据此建立了测定色氨酸的化学发光分析新方法。采用顺序注射技术进样，将试样和试剂的消耗降至微升范围内，明显提高了分析速度。考察了各种实验参数的影响和可能的反应机理，此反应的发光体为Tween 40的中间氧化产物。在试样体积70 μL、吐温40浓度为5%、试剂Ce体积80 μL、浓度为1.0 mmol/L、检测流速为1.8 mL/min的条件下，线性范围为2.0×10-7～1.4×10-5 mol/L; 检出限(3σ)为8.8×10-8 mol/L; 对6.0×10-6 mol/L色氨酸进行9次测定的相对标准偏差为1.3%。啤酒和血清中色氨酸含量测定的回收率为91.2%～102%。

【关键词】 顺序注射，化学发光，吐温40，色氨酸

　　1 引 言

　　色氨酸(Trp)是蛋白质中最基本的氨基酸之一，是建立和维持人体内氮平衡的必不可少的一种氨基酸，它也是神经递质的前体，具有重要的生理作用[1]。但色氨酸不能由人体自身合成，需由外界补充，因此建立快速准确测定色氨酸的分析方法十分必要。目前，测定氨基酸的方法多为高效液相色谱分析法。由于在样品预处理的强酸水解过程中色氨酸会被完全破坏，所以多采用碱水解进行预处理，单独进行测定[2]。利用色氨酸在紫外区的特征吸收，用光度分析法测定[3]，结合色谱分离[4]及采用化学计量学法分辨[5]提高方法的选择性，或利用色氨酸自身的荧光特性，用荧光光度法检测[6～9]。此外，也有将电化学法[10～12]和化学发光法[13～15]用于色氨酸测定的报道。

　　本实验发现，在酸性介质中，当有色氨酸存在时，Ce和吐温40(Tween 40)之间的化学发光反应强度明显增强。基于此，将顺序注射(SI)进样和化学发光(CL)检测联用，建立了简便、快速、灵敏、选择性好的测定色氨酸含量的分析方法，采样频率达100样/h，并探讨了可能的反应机理。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　顺序注射系统由两个注射泵各配置一个2.5 mL针筒和两个多位选择阀V1和V2(Valco， Houston， TX， USA)组成;泵和阀的操作由计算机通过FIALab 5.0软件自行编程进行控制。检测装置为BPCL微弱发光分析仪(中国科学院生物物理研究所)。化学发光流通池由内径0.5 mm 半透明的PTFE管自制而成。Y型三通与阀V1和V2之间连接管路长均为5 cm，测定流路见图1。

　　氨基酸试剂均购自Sinopharm化学试剂公司。氨基酸储备液(1.0 mmol/L): 除酪氨酸用0.004 mol/L NaOH溶解配制外，其它各种氨基酸都用水溶解配制，保存在4 ℃冰箱内。5.0 mmol/L Ce溶液(含0.3 mol/L h3SO4)和10%Tween 40溶液，根据需要适当稀释。以上试剂均为分析纯，水为二次去离子水。

　　2.2 实验方法

　　首先经泵P1和P2分别吸入一定体积的去离子水作为载流，再通过阀V1和V2分别吸入80 μLCe溶液和70 μL试样溶液到各自储存管路中，然后改变两泵运行方向，推动试剂和试样溶液在T型连接处混合，在反应管路反应，经流通池后排出废液，并记录发光信号。 分 析 化 学第37卷第8期高春英等：Ce吐温40色氨酸化学发光体系的研究与应用

　　 3 结果与讨论

　　3.1 实验参数优化

　　顺序注射进样由两个试剂区带组合构成，一个是酸性Ce溶液，另一个是Tween 40与色氨酸标准表1 实验参数优化结果

　　Detection flow rate (mL/min)1.8h3SO40.06 mol/L(或样品)的混合溶液，采用汇合流方式混合，以便增加试剂和试样的混合程度。以发光信号强度为响应函数，兼顾信号的重现性，对实验参数进行了优化，优化后数据列于表1。

　　3.2 共存物质的影响

　　为了评价此方法的选择性，考察了可能的共存物质对1.0 μmol/L Trp测定的干扰情况。在相对误差±5%范围内，以下浓度的物质均不干扰Trp的测定：1000倍的亮氨酸、葡萄糖、柠檬酸钠、Ac-， HCO-3， Al3+， NH+4， Zn2+， Ca2+和 Mg2+， 600倍的苏氨酸、脯氨酸， 500倍的氨基乙酸和Co2+， 400倍的组氨酸和缬氨酸， 200倍的Cr3+， 100倍的半胱氨酸、Fe2+和Fe3+， 50倍的丝氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和Cu2+， 25倍的甘氨酸， 10倍的蛋氨酸， 7倍的胱氨酸盐酸盐和5倍的酪氨酸。

　　3.3 线性范围、检出限和重现性

　　在选定实验条件下，色氨酸的浓度在2.0×10-7 ～ 1.4×10-5 mol/L范围内与相对化学发光强度的关系为：ΔICL=11.32+498.06CTrp-14.33C2Trp(CTrp： μmol/L)，R2=0.9990，检出限(3σ)为8.8×10-8 mol/L，RSD=1.3%(n=9，CTrp=6.0×10-6 mol/L)。

　　3.4 反应机理研究

　　在相同浓度酸性介质条件下测定了相应反应物和反应混合物的化学发光光谱(图2)、吸收光谱(图3a)和荧光光谱(图3b)。 图2 反应产物的化学发光光谱

　　Fig.2 Chemiluminescence spectra of reaction products图2是用400～588 nm滤光片，在表1条件下测定的化学发光光谱。比较CeTween 40Trp与CeTween 40两条曲线可以看出，当色氨酸存在时，发光强度明显增强，两个发光反应的最大发射波长均位于470～488 nm之间.说明尽管两个反应的发光强度不同，但发光体应是同一物质。

　　比较图3a中吸收曲线1、3和6可见，曲线3在227 ～ 400 nm范围内吸收峰并不是色氨酸或Ce产生的，而应是CeTrp的反应产物产生的吸收;由于Ce在227～600 nm无吸收，所以该位置的吸收峰应该是Trp氧化产物产生。比较曲线1、4和5可见，曲线4在231～275 nm内的吸收峰应是Tween 40的氧化产物;曲线2在231～275 nm的峰形与曲线4相似，说明在CeTween 40Trp反应中也形成了Tween 40的氧化产物。

　　由图3b可见，CeTrp、CeTween 40、CeTween 40Trp 3个反应体系的最大荧光发射峰均在350 nm处，这与Ce的最大发射峰位于350 nm一致，说明这3种反应体系中都有Ce产生，且随着Trp的加入荧光强度比CeTween 40反应增大。实验还观察到反应物和反应混和物在510 nm附近还产生一定强度的荧光发射。由于Ce本身没有荧光性，而Trp在此又没有产生荧光发射，所以，510 nm处的发射峰只能是来自Trp的氧化产物。

　　图3 反应物和产物的吸收光谱(a)和荧光光谱(b)

　　Fig.3 Absorption spectra(a) and fluorescence spectra(b) of reactants and reaction products

　　5.0×10-5 mol/L色氨酸(tryptophan， Trp); 0.5% Tween 40; 5.0×10-5 mol/L Ce; 2.5×10-4 mol/L Ce。1. Ce; 2. CeTween 40Trp; 3. CeTrp; 4. CeTween 40; 5. Tween 40; 6. Trp; 7. Ce.Ce有很强的荧光特性，可能是相应发光反应中发光体。文献[13]报道，包括维生素C在内，一些还原性物质，如亚砷酸盐、Ti、Fe(CN)4-6、叶酸和等代替色氨酸与Ce反应，并没有产生化学发光。说明Ce不是该反应产生化学发光的原因。况且Ce在430～600 nm也没有荧光发射(图3b中曲线2)，而CeTween 40Trp反应体系的发光是在可见区(见图2中λem= 488和 532 nm)，这进一步说明Ce不是该反应的发光体。

　　由于CeTween 40Trp化学发光反应体系的最大发射波长位于470 ～ 488 nm之间(图2)，而反应物和反应产物的荧光光谱在这一范围内都没有产生发射峰，据此可以推断反应的发光体既不是Ce，也不可能是Tween 40或Trp的最终氧化产物，而应是该反应的中间氧化产物。由于CeTween 40Trp与CeTween 40发光体为同一物质，所以也不可能是色氨酸的中间氧化产物，而应为Tween 40被Ce氧化后产生的中间氧化产物。失水的山梨醇脂可能是Tween一类非离子表面活性试剂产生化学发光的基本结构[16]。

　　根据以上讨论，CeTween 40Trp发光体系的反应机理可以描述如下：

　　Ce + Trp→Ce*+ Trpox(1)

　　Ce + Tween 40→Ce* + Tween 401ox(2)

　　Ce* + Tween 401ox→Ce + [Tween 401ox]*(3)

　　[Tween 401ox]*→Tween 40ox + hv(4)

　　其中， Tween 401ox为中间氧化产物。

　　3.5 样品分析

　　取血清1.0 mL于4.0 mL塑料离心管内，加入1.0 mL 5% 三氯乙酸，加盖后于旋涡混匀器上混匀1 min，室温下放置15 min，以3000 r/min离心15 min，取上清液80 μL与5 mL 10% Tween 40混合稀释到10 mL，按2.2节所述进行测定。对于氨基酸注射液和啤酒试样，根据样品中含量进行不同倍数稀释即可。测定结果列于表2。由表2可见，本方法有较好的实用性。表2 测定结果和回收率

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