超高效液相色谱串联质谱法测定牛奶和奶粉中6种聚醚类抗生素残留量

　　　　 作者：薄海波　 雒丽丽　 曹彦忠　 星玉秀　庞国芳

【摘要】 建立了用于检测牛奶和奶粉中拉沙洛菌素、莫能菌素、尼日利亚菌素、盐霉素、甲基盐霉素和马杜霉素铵6种聚醚类抗生素残留量的超高效液相色谱串联质谱分析方法。用乙腈提取样品中的聚醚类抗生素，提取液经HLB固相萃取柱净化，采用超高效液相色谱分离，以电喷雾离子源正离子多反应监测模式进行质谱分析。6种抗生素在0.5～100.0 μg/L范围内均呈线性，相关系数r&>0.99。在空白样品中添加6种聚醚类抗生素的回收率均在74.0%～98.5%之间; 精密度(RSD)4.8%～17.2%。牛奶中6种聚醚类抗生素检出限均为0.2 μg/L;奶粉中6种聚醚类抗生素检出限均为1.6 μg/kg。

【关键词】 聚醚类抗生素，残留分析，超高效液相色谱串联质谱，牛奶，奶粉

　1 引 言

　　聚醚类抗生素(polyether antibiotics)又名离子载体抗生素，是目前广泛应用于畜禽饲养业的高效、广谱抗球虫药和促生长剂。聚醚类抗生素在毒理学上属于高毒或剧毒物质，具有强细胞毒性，安全范围小。过量使用聚醚类抗生素会导致动物产品中药物残留，严重危害人体健康。加拿大、中国、欧盟和美国等许多国家或国际组织制定了聚醚类抗生素残留限量。各国对动物源性产品中聚醚类抗生素的残留限量要求均低于1.0 mg/kg。欧盟规定牛奶中莫能菌霉素限量为0.002 mg/kg。目前，国内只有关于饲料与肉制品中莫能菌素或盐霉素等单组分聚醚类抗生素残留量测定方法的国家标准[1～3]，还没有牛奶和奶粉中聚醚类抗生素残留量测定方法的国家标准或有关行业标准。

　　关于聚醚类抗生素残留检测研究的报道，主要是针对莫能菌素和盐霉素的测定，其主要方法有液相色谱法[1～12]、微生物法[13]和分光光度法[14]。由于聚醚类抗生素不具有紫外吸收官能团，液相色谱紫外检测法需要衍生化，包括柱前衍生化法[1～6]和柱后衍生化法[7～12]。采用液相色谱质谱法则不需要烦琐的衍生化，且避免了衍生化步骤带来的目标物损失，方法回收率和灵敏度大幅提高。目前，国外已有采用液相色谱串联质谱仪测定聚醚类抗生素残留的报道[15，16]。

　　本实验采用超高效液相色谱串联质谱联用技术，研究了牛奶和奶粉中拉沙洛菌素、莫能菌素、尼日利亚菌素、盐霉素、甲基盐霉素和马杜霉素铵6种聚醚类抗生素残留的定性与定量分析方法。用乙腈提取样品中聚醚类抗生素，离心，上清液减压蒸干后甲醇水溶解残渣，HLB固相萃取柱净化，超高效液相色谱串联质谱仪测定，外标法定量。6种聚醚类抗生素在牛奶和奶粉中残留量的检出限均≤1.6 μg/kg，可满足国内外对牛奶和奶粉卫生质量监控要求。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　Acquity UPLCQuattro Premier XE MS/MS超高效液相色谱/串联质谱仪(Waters公司)，配置电喷雾(ESI)离子源;超声波振荡器(上海科导公司);涡旋混匀器( 公司);离心机(北京医用离心机厂);旋转蒸发仪(Heidolph公司)， 配真空泵;超纯水机(MilliQ公司); 0.22 μm有机系过滤膜(Waters公司);Oasis HLB固相萃取小柱(3 mL，60 mg，Waters公司)， 使用前依次用3 mL甲醇和5 mL水活化，保持柱体湿润。拉沙洛菌素(lasalocid)、莫能菌素(monensin)、尼日利亚菌素(nigericin)、盐霉素(salinomycin)、甲基盐霉素(narasin)、马杜霉素铵(madubamycin ammonium)标准品(纯度≥95%，Dr. Ehrenstorfer GmbH公司);100 mg/L各标准储备液：准确称取各标准品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，-18 ℃避光保存;正己烷、乙腈和甲醇(农残级，Merck公司);甲酸和乙酸铵(优级纯，北京市化工技术有限公司);无水硫酸钠(分析纯，西安化学试剂厂)：用前在650 ℃灼烧4 h，置于干燥器中冷却后备用;水为超纯水(自制)。

　　2.2 实验条件

　　2.2.1 色谱分析条件 Acquity BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm， i.d.， 1.7 μm， Waters公司);柱温40 ℃;流动相：0.1%甲酸(含5 mmol/L乙酸铵)甲醇(10∶90， V/V)，流速：0.25 mL/min;进样量：5.0 μL。

　　 2.2.2 质谱分析条件 电喷雾离子源;正离子扫描(ESI+);检测方式：多反应监测(MRM);毛细管电压： 2.8 kV;离子源温度： 110 ℃;去溶剂气温度： 380 ℃;去溶剂气(N2)流量：600 L/h;锥孔气(N2)流量：50 L/h; 碰撞气(高纯Ar)流量： 0.1 L/h;锥孔电压、碰撞能量及定性和定量离子对等质谱参数表1。表1 6种聚醚类抗生素的质谱参数和参考保留时间

　　2.3 样品制备

　　2.3.1 提取 液态奶类样品：量取10.0 mL液态奶试样于50 mL聚丙烯离心管中，加无水Na2SO4约10 g和乙腈20 mL，涡旋混匀 1 min，振荡10 min，以3000 r/min离心3 min，取出上层清液。用20 mL乙腈重复提取一次，合并上清液。加10 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋 1 min，弃去正己烷，减压浓缩至近干。用4 mL V(甲醇)∶V(水)=50∶50混合液溶解残渣，待净化。

　　奶粉类样品：取12.5 g 奶粉于烧杯中，加适量35～50℃水溶解，待冷却至室温后，用水定容至100 mL，充分混匀。取10.0 mL样品溶液于50 mL聚丙烯离心管中，按液态奶类样品提取步骤处理。

　　2.3.2 净化 将样品溶液加载到Oasis HLB固相萃取小柱中，并用3 mL V(甲醇)∶V(水)=50∶50混合液淋洗至浓缩瓶，并入小柱。依次用5 mL水和3 mL V(甲醇)∶V(水)=50∶50混合液淋洗小柱， 4 mL甲醇洗脱。用氮气吹干仪将洗脱液吹干，并迅速用流动相定容至1.0 mL，滤膜过滤，用于UPLCMS/MS测定。

　　3 结果与讨论

　　3.1 提取条件的选择

　　3.1.1 提取剂的选择 聚醚类抗生素分子中含有多个环状醚键，结构特征是在直链碳骨架上连成多个四氢呋喃、四氢吡喃等含氧杂环;分子一端有1个羧基;在结晶状态，分子两端可借助氢键相连而成环状构型，具有离子载体性质，可形成多种金属盐，常以钠盐、钾盐或铵盐形式存在。微溶或不溶于水，易溶于低级醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等。在中性或碱性环境中稳定，其游离酸稳定性较差。根据以上特点，选择甲醇、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷为提取剂，对比提取效果。用甲醇提取时，需要用酸沉淀牛奶中的蛋白质，而聚醚类抗生素在酸性环境下稳定性较差，回收率较低。用乙酸乙酯和二氯甲烷提取，提取液中脂溶性共提物较多，为下一步净化带来困难。乙腈既可以避免共提出太多的脂溶性杂质，又能得到满意的回收率，6种聚醚类抗生素回收率均可&>75%。本实验选择乙腈为提取剂。

　　3.1.2 提取剂的用量和提取次数的优化 取10.0 mL试样和10 g无水Na2SO4，用20 mL乙腈提取，提取2次，回收率&>75%; 第3次提取时，溶液中基本上未检出聚醚类抗生素。改用10 mL乙腈提取3次，回收率不稳定，第3次提取溶液中仍可检出聚醚类抗生素。故选用20 mL乙腈提取两次。

　　3.2 净化方法的选择

　　考察了固相萃取法、正己烷液液萃取法及凝胶渗透色谱(GPC)的净化效果。牛奶类样品基质复杂，尤其是配方奶粉中，存在多种维生素等添加成分，采用液液萃取法净化，不足以去除奶粉中的干扰物质;聚醚类抗生素分子量分布范围较宽(MW 612～934)，采用GPC净化的收集时间长(8～35 min)，与脂肪的流出时段(7.5～17.5 min)有交叉，净化效果不理想;本实验采用正己烷除脂后，对比了硅胶柱、C18柱、Oasis HLB柱的净化效果。实验显示，Oasis HLB固相萃取小柱去除杂质干扰效果好，简便快速，6种聚醚类抗生素的回收率均在85%～105%之间。

　　3.3 液相色谱串联质谱分析条件的确定

　　3.3.1 优化质谱分析条件、确定母离子和监测离子 采用注射泵直接进样方式，以10 μL/min将聚醚类抗生素的标准溶液注入串联质谱的离子源中。采用正离子扫描方式进行一级质谱分析，在选定的质谱条件下，聚醚类抗生素的产生稳定的强峰，确定了母离子(尼日利亚菌素母离子为[M+NH4]+， 其余5种抗生素母离子均为[M+Na]+)，优化了电离电压。对被测物的母离子进行二级质谱分析，得到子离子质谱图，选择了监测离子，优化了碰撞能量。还对离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔反吹气流量等参数进行了优化。质谱参数及母离子和子离子详见表1。

　　3.3.2 色谱条件的确定 选用通用性强的BEH C18色谱柱，以甲醇水(含0.1%甲酸)为流动相，6种抗生素能得到较好分离，但峰型不对称，有拖尾现象，在水系流动相中加入5 mmol/L乙酸铵后，峰形得到有效改善。本实验确定的流动相为V(0.1%甲酸)∶V(5 mmol/L乙酸铵甲醇)=10∶90混合溶液。各组分保留时间参见表1。

　　3.4 标准曲线、线性关系及检出限

　　基质抑制效应在液质分析中表现明显，不同物质受到的影响程度有较大差异。对比了3种标准曲线：(1)采用流动相稀释标准溶液作标准曲线，添加样品中莫能菌素、尼日利亚菌素和马杜霉素铵回收率均可达到80%～120%，而拉沙洛菌素和盐霉素回收率&<20%，甲基盐霉素回收率为50%～65%; (2)按照样品提取、净化操作步骤提取净化空白牛奶或奶粉样品， 以稀释的最终标准溶液作标准曲线。甲基盐霉素和盐霉素回收率分别为56%和35%;(3)将标准溶液添加到牛奶或奶粉中，按照样品提取、净化操作步骤同步操作， 最终样液作为基质校正标准溶液作标准曲线，各组分回收率均满意。故本实验选择基质校正标准曲线。

　　在牛奶空白样品中加入1.0， 2.0， 5.0， 10.0， 20.0， 50.0和100.0 μg/L系列浓度的6种聚醚类抗生素，按照2.3制备基质校正标准溶液，仪器响应峰面积Y对的聚醚类抗生素浓度X进行线性回归，6种被测物质的线性良好(见表2)。表2 聚醚类抗生素的回归方程、相关系数和线性范围

　　Linear range(μg/L)拉沙洛素 LasalocidY=82.5X+17.550.9901.0～100.0莫能菌素 MonensinY=981.9X+83.370.9991.0～100.0尼日利亚菌素 NigericinY=1067.9X+245.960.9991.0～100.0盐霉素 SalinomycinY=153.7X+20.530.9931.0～100.0甲基盐霉素 NarasinY=720.8X+98.180.9941.0～100.0马杜霉素铵 Madubamycin ammoniumY=156.7X+16.510.9991.0～100.0 注(note)：Y: 定量离子对峰面积(peak area)，X: 标准溶液浓度(concentration of standard solution， μg/L)。 根据10倍信噪比，并计入试样量及最终定容体积后，得出抗生素在牛奶和奶粉中的检出限。牛奶中6种聚醚类抗生素的检出限均为0.2 μg/kg;奶粉中6种聚醚类抗生素的检出限均为1.6 μg/kg。空白样品及添加限量水平样品的UPLCMS/MS多反应监测(MRM)色谱图见图1。

　3.5 实验室内回收率和精密度实验数据

　　采用标准添加法，在空白样品中，添加4个浓度水平的聚醚类标准品溶液，每个添加水平平行测定6次，测定结果见表3。实验数据表明，本方法的回收率在74.0%～98.5%范围内; 测试精密度(RSD)介于4.8%～17.2%之间，结果令人满意。表3 空白样品添加聚醚类抗生素的回收率及精密度(n=6)

参考文献

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